含量测定类方法验证中的统计学评价

含量测定类方法验证中的统计学评价

黄奕睿

广东金城金素制药有限公司 528400

摘要：在进行质量研究时，必须对所采用的方法论进行检验，确保在进行质量分析时所采用的分析手段可以开展方法学验证，可以有效地应用于临床试验中的药品质量管理中。为了对不同的分析方法的验证要求进行规范，2005年我国制定了分析方法的验证原则。该原则较为详尽地介绍了所需检验的分析手段和具体的检验指数。

关键词：含量测定；验证；统计学评价

引言

大部分药物研发企业在进行质量研究时，已经意识到了检验方法的重要性和必要性，大部分药物研发企业也在严格的检验规范下进行了分析方法的验证，但由于在验证完成后没有一个清晰的可被认可的规范，所以很难确定这种分析方法的有效性。文章结合国外几家大型制药企业在这一领域的需求，提出了含量测定的方法验证中所采用的可接受的标准，以作为我国医药科研机构开展相关试验的依据。

1、含量测定分析方法验证

1.1容量分析法

容量分析法（亦称滴定法）是用滴定管将确定浓度的滴定液（标准物质的液体）滴入被检测的药物溶液中，直到滴定液中含有标准物质（通常称作滴定剂）与受试药剂进行充分的反应（用合适的方式指示），接着，按照滴定液中的滴定剂（通常称作滴定液浓度）的浓度和所用的体积，按照化学计量的方式来计算被测试药物的含量。

1.1.1容量分析法的特点

（1）该方法操作简便，所用的设备价格低廉，易于获得，操作简单，快速。

（2）该方法具有良好的耐用性：实验条件及周围环境对该方法的影响很小。

（3）该方法的准确率相对较高，一般相对误差不超过0.2%，适合于高准确度的实验样品的分析。

（4）方法特异性差：该方法缺少对类似结构的有关物质或其它影响因素的杂质的选择性较差，所以通常用于分析主要成分当中含量相对较高的实验样品中。

1.1.2容量分析法的使用范围

由于容量分析法具有以上特征，在化工原料药物中的含量检测中得到了普遍的使用，但在药品制剂中的含量检测却很少见。

1.1.3容量分析法的有关计算

（1）滴定度

《中国药典》中，用毫克（mg）标示，每1毫升指定浓度的滴定液等于被检测药物的质量。比如用碘计量法测量维生素C的含量,ChP中的标准是：1毫升碘滴定溶液（0.05摩尔/升）等于8.806毫克的C6H8O6（维生素C）。

（2）滴定度的计算公式

T（mg/ml）=m×（a/b）×M

在计算公式中，m是滴定液的摩尔浓度（mol/L）；a、b分别为滴定反应公式中所测定的药剂与滴定剂的摩尔数；M是被测试药剂（用mg来表示分子量）的毫摩尔质量。

1.2光谱分析法

光谱分析法使用的光谱范围为从紫外区到红外区。《中国药典》上常见的测定方法有：紫外可见分光度法，红外分光光度法，以及原子吸收分光光度法。

1.2.1紫外可见分光光度法

该法是一种在190~800nm的光谱范围中检测药物物质光度吸收的方法，它可以作为药物鉴别、杂质检测和定量分析的一种新的手段。

（1）朗伯比尔定律

在某一特定的浓度范围下所能被该物质吸附的数量与该物质浓度及液层厚度成正比例关系。

（2）方法特点与适用范围

识别方便：该方法所用的设备成本低、操作简便、便于推广。

该方法具有较高的敏感性，敏感度可以达到10-6g/ml，适合于测定较低浓度的试验样品的分析。

该方法具有很高的精确性，具有不超过2%的相对误差，适合于要求高精度测定结果的实验样品的分析。

特异性差：该方法不会受到普通杂质的影响，但对结构类似的相关物质缺少选择性。

（3）仪器校正和检定

波长：仪器的波长会因周围的情况而发生轻微的变化。使用的仪器，除要经常进行校准以外，还要在测量之前对测量的波长进行校正。

1.3色谱分析法

色谱分析法是由将混合物中早已被提取出来物质所表现的色谱行为差异，将各个组分从混合物内进行分离出来，之后有选择性地向待测组分开展分析的一种方法。因此，用色谱分析法开展混合物的分析是很有效的方法。

1.3.1高效液相色谱法（HPLC）

（1）方法的特点与适用范围：

高灵敏度：HPLC检测的最小浓度值可以达到10-12~10-9克/ml，这取决于检测装置。

高特异性：HPLC能高效地从复合基体样本中提取出与受试组分结构相似的相关杂质或不相关的干扰物质，且其检测信号的特异性很高，能对受试组分进行选择性地检测。

高效率和高速度：HPLC一般可以在10-20min内进行药物的定量分析，或30min内同时进行药物复方制剂中多组分的定量分析，或在60min之内进行药物相关物质的分离和定量化。

（2）测定法

在定量分析时，可以按样品或设备的特定条件对药物进行峰高或峰面积进行测量。现在大部分采用的是利用峰面积进行计算。

1.3.2气相色谱法（GC）

气相色谱分析中，以气体为依托，根据注入配有填充剂的色谱柱开展分离测量的色谱分析，物质或者其衍化物在气化后，由载气送入色谱柱开展分离，成分先后送入检测器，用数据处理方法对色谱标记开展记录。

（1）方法的特点与适用范围

此方法用于对带有挥发性或者其衍生物具有挥发性的药物以及相关物质开展测定，在ChP2015中被广泛用于测定残余的溶剂、水分测定以及酒剂或酊剂中甲醇含量检测等有关杂质的检测，及其对于某些脂溶性很强的药物和制剂开展含量测定，如维生素E的测定。

（2）测定法

方法包括内标法、外标法和加入法。内标法和外标法与高效液相色谱法相同，本文重点叙述了加入法：

精确称量受检组的适量对照品，配比为合适的浓度，并将其按一定比例精确地添加到受试品的溶液中，按外标法或内标法测量受试品的含量，减去所添加的受检组对照品的量，得到受检样品中所测成分的含量。

2、含量测定类方法验证中的统计学评价

2.1准确度与精密度的概率统计评价

1)在含量方法准确度考察中，平均回收率一般应在98.0%~102.0%范围，三种浓度九份样品回收率数据的RSD应不大于2.0%。

含量方法验证通过含量精密度与准确度的恰当结合，应用统计t分布概率来判定准确度结果是否在可接受标准范围。概率的接收标准为不小于0.95。

2）杂质方法准确度在分析浓度线性范围内采用加样回收率研究。评估的范围一般为限度水平的50%-150%。

2.2准确度与精密度置信区间评价

样品分析测试结果可以表示用下面等式模型表示：

Y=t+b+E

Y：报告值

t：真实或可接受的标准值

b：方法系统误差

E：方法随机误差

对于一个可靠的分析方法，一般来说t和b是固定的值。E值是一个均值为零、标准差为σ（sigma）且符合正态分布的随机变量。

分析方法的准确度表示了报告值(Y)与真值(t)之间的一致性。它们之间的接近程度表示为（Y-t）的平均值，即系统误差b。USP<1225>通则提及用标准品或者另一个良好的正交方法得到的真值（t）进行赋值。准确度的建立应在分析方法的要求范围内。

3、结语

药品中主要成分的数量是衡量药品质量的一个主要因素。常用化学、物理学、生物学和微生物等方法对药品进行含量检测，是衡量药品品质和药品质量标准的一个重要手段。目前常用的药品含量分析手段有：容量法、光谱法、色谱分析法等。在这些方法中，容量分析法具有操作简单、结果精度高、方法寿命长等优点，但由于缺少特异性，所以适合于需要高结果准确度和精密度的药物。光谱分析法是一种简单、快捷、高灵敏度、一定准确度的检测方法，但其特异性较低，适合于高灵感性、样品量大的检测项目。色谱分析法敏感性高，专属性强，但其结果的计算必须采用参照物，该方法一般用于复杂的样本含量测定中，且其特异性和敏感性都要求较高。

参考文献

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