miR-377-3p调控LASP1抑制食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭

miR-377-3p调控LASP1抑制食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭

方娜1,,吕露2,,丁国文2,,邱彩玉3,,李娟1施益军2*

1江苏大学附属人民医院肿瘤科，中国镇江212002   2江苏大学附属人民医院胸心血管外科，中国镇江212002  3江苏大学附属人民医院消化科，中国镇江212002

[摘要]目的：探究miR-377-3p在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC) 中的表达和作用机制。方法:qRT-PCR检测ESCC组织和细胞中miR-377-3p的表达。分析miR-377-3p与临床病理特征之间相关性。构建miR-377-3p高低表达的食管癌细胞株，通过western blot验证miR-377-3p对下游的靶基因LASP1的调控关系，并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-377-3p与LASP1之间的相互作用。结果:miR-377-3p在ESCC组织和细胞中明显低表达。miR-377-3p与ESCC患者的肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移呈负相关。在ESCC中miR-377-3p通过调控LASP1表达抑制食管癌增殖、迁移和侵袭。结论：miR-377-3p通过调控LASP1抑制食管癌的增殖、迁移和侵袭，它可以作为ESCC的预后分析及潜在的治疗靶点。

关键字: 食管鳞状细胞癌; miR-377-3p; LASP1

[Abstract]: Objective to investigated miR-377-3p expression within esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) as well as its mechanism of action. Methods we performed qRT-PCR for detecting miR-377-3p levels within ESCC tissues and cells. Besides, the correlation of miR-377-3p with clinicopathological features was analyzed. In-vitro experiments, we constructed the ESCC cell lines with high/low miR-377-3p expression. Further, miR-377-3p’s regulatory effect on LASP1 was verified through western blot. The interaction between miR-377-3p and LASP1 was verified by Dual-luciferase reporter gene assay.ResultsmiR-377-3p was lowly expressed within ESCC cells and tissues. Apart from that, miR-377-3p was negatively related to the tumor size, lymph node metastasis (LNM) and clinical stage of ESCC. miR-377-3p regulated LASP1 expression in ESCC in order to inhibit ESCC proliferation, migration and invasion. ConclusionmiR-377-3p regulates LASP1 expression to inhibit proliferation, invasion and migration of ESCC, which may play a role as the marker to predict prognosis and treatment for ESCC.

Key words:ESCC; miR-377-3p; LASP1

前言

食管癌 (esophageal cancer, EC) 是全球常见的恶性肿瘤之一，在10种最常见的癌症中食管癌的发病率居于第七位，在癌症相关死亡原因中居第六位[1]。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）在食管癌中最为常见，所占比例可高达90%[2]。早期食管癌患者术后5年生存率可高达80～90% [3]。但由于许多食管癌患者确诊时病期较晚或有远处转移，食管癌总的5年生存率仅有20%～40%，在中国，食管癌的5年生存率仅为29.7%[4]。因此，从分子水平研究食管癌的发病机制，寻找食管癌的治疗靶点非常迫切。

本研究发现miR-377-3p在70例ESCC患者癌组织和食管癌细胞系中低表达，在有淋巴结转移的癌组织中表达明显低于无淋巴结转移的癌组织。miR-377-3p在ESCC中的表达与肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移呈负相关。miR-377-3p可通过调节LASP1抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

1. 资料和方法

1.1一般资料

收集我院2015年1月-2019年12月共70例未经术前化疗、放疗等其他治疗的ESCC手术患者的组织标本，所有组织经术后病理确诊。所有组织样本的采集均在肿瘤切除离体后的5分钟左右完成，并放置于液氮中长期保存。

1.2 细胞培养

正常食管上皮细胞HET-1A和5株食管癌细胞ECA109、TE-13、Kyse150、Kyse510、Kyse450均购于中科院上海细胞库，采用含1%青霉素、1%链霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 培养基在37℃，5%CO2环境的培养箱中培养。

1.3 qRT-PCR （quantitative real time PCR）

细胞内总RNA采用Trizol试剂进行提取，组织样本总RNA采用GeneJET RNA Purification Kit  试剂盒提取，提取方法根据各试剂说明书进行。采用2−ΔΔCT法计算基因相对表达量，用U6对microRNA的表达水平进行标准化。实验中所用引物及其序列列举在表1中。

表一   引物序列信息

1.4 miRNA模拟物和miRNA抑制剂的构建与转染

miRNA-377-3p模拟物(miRNA-377-3p mimic)、抑制剂 (miRNA-377-3p inhibitor) 及对照 (mimic-NC、inhibitor-NC) 由上海吉玛基因有限公司设计合成。序列分别为 (5’至3’)：

miR-377-3p mimic: sense AUCACACAAAGGCAACUUUUGU

antisenseAAAAGUUGCCUUUGUGUGAUUU

miR-377-3p mimic-NC: sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

antisenseACGUGACACGUUCGGAGAATT

miR-377-3p inhibitor: ACAAAAGUUGCCUUUGUGUGAU

miR-377-3p inhibitor-NC: CAGUACUUUUGUGUAGUACAA

根据说明书用Lipofectamine 2000将miR-377-3p mimic、miR-377-3p inhibitor及相应的对照序列分别转染至ESCC细胞中。

1.5双荧光素酶报告基因实验

将LASP1-wt或LASP1-mut构建入双荧光素酶报告载体（GP-miRLOGO）中。在24孔板中每孔种植5×104个ECA109细胞，培养24小时后进行转染。通过Lipofectamine 2000将双荧光素酶报告基因质粒和miR-377-3p mimic或mimic NC在ECA109细胞中共转染。48小时后，使用双荧光素酶报告检测试剂盒（Promega，WI，USA）测量荧光素酶活性。

1.6 Western blotting (WB) 实验

使用RIPA裂解缓冲液提取转染后培养48 h的ESCC细胞的蛋白质，并使用BCA试剂盒定量检测。将20ug蛋白样品通过电泳分离并转移到PVDF膜上后，将膜放入封闭液中37℃摇床上慢摇封闭1h。封闭完成后，加一抗4℃孵育过夜，加二抗37℃孵育1小时，ECL化学发光显色，然后凝胶成像仪进行处理分析。

1.7统计分析

数据分析采用SPSS 21.0软件。实验数据采用均数±标准差的方式表示。组间两两比较采用的t检验法，Pearson卡方检验方法分析miR-377-3p表达水平与临床参数特征的关系。P < 0.05认为差异存在统计学意义。

2结果

2.1 miR-377-3p在人类ESCC组织和细胞系中的表达水平降低

在70例患者组织标本中发现miR-377-3p在食管癌组织中表达明显低于癌旁正常组织（图1A），在有淋巴结转移的癌组织中表达明显低于无淋巴结转移的癌组织（图1B）。miR-377-3p的表达与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期呈负相关，但与年龄、性别、肿瘤浸润深度及组织分化程度无明显的关系（表2）。miR-377-3p在不同的食管癌细胞系中的表达均明显低于在正常食管细胞中的表达，其中miR-377-3p在ECA109细胞中最高，在TE-13细胞中最低 (图1C)。这些实验数据提示我们miR-377-3p在食管癌的增殖、侵袭和转移过程中发挥了抑制作用。

图1.miR-377-3p在ESCC的癌组织和食管癌细胞系中高表达。（A）qRT-PCR检测70对ESCC患者的癌组织及配对的癌旁正常组织中miR-377-3p的表达。 (B) qRT-PCR检测70对ESCC患者中无淋巴结转移的癌组织和有淋巴结转移的癌组织中miR-377-3p的表达。(C) qRT-PCR检测正常食管上皮细胞和食管癌相关细胞系中miR-377-3p的表达情况。**P< 0.01, ***P < 0.001。

表二:70例ESCC患者的癌组织中miR-377-3p表达水平与临床病理特征之间相关性

*P < 0.05

3.2 在ESCC细胞中升高或降低miR-377-3p的表达

将miR-377-3p mimic转染入TE13细胞后进行qRT-PCR检测，miR-377-3p mimic可以明显升高miR-377-3p在TE13细胞中的表达(图2A)。将miR-377-3pinhibitor转染入ECA109细胞。结果提示miR-377-3pinhibitor 可以明显降低miR-377-3p在ECA109 中的表达 (图2B)。

图2：在TE-13和ECA109细胞中升高或降低miR-377-3p的表达。（A） miR-377-3p mimic可以明显升高miR-377-3p在TE13细胞中的表达。（B）miR-377-3pinhibitor 可以明显降低miR-377-3p在ECA109 中的表达

3.3在ESCC细胞中干扰miR-377-3p表达对LASP1表达的影响

我们通过检索TargetScan和miRDB数据库发现LASP1是miR-377-3p下游靶基因，并预测到LASP1与miR-377-3p的结合位点（图3A和3B）。Western blot显示ECA109和TE-13细胞中miR-377-3p的表达降低后LASP1蛋白水平明显增加 (图3C和3D), 上调ECA109和TE-13细胞中miR-377-3p的表达后能明显抑制LASP1蛋白水平 (图3E和3F)。说明在ESCC中LASP1有可能是miR-377-3p的靶基因。

图3: 在ECA109和TE-13细胞中干扰miR-377-3p表达对LASP1表达的影响。（A和B） TargetScan和miRDB预测到LASP1与miR-377-3p的结合位点。（C和D）Western blot检测低表达miR-377-3p后对LASP1蛋白的影响。（E和F）Western blot检测高表达miR-377-3p后对LASP1蛋白的影响。

3.4 通过双荧光素酶报告基因实验直接证明在ESCC细胞中miR-377-3p可与LASP1结合

我们针对miR-377-3p和LASP1的结合位点设计合成LASP1的野生型与突变型双荧光素酶报告基因质粒（图4A）。将LASP1野生型和突变型质粒分别与miR-377-3p mimic或miR-NC mimic共同转染到ECA109细胞，实验结果提示miR-377-3p只能降低LASP1野生型质粒的荧光素酶活性，对突变型质粒的荧光素酶活性无影响（图4B）。这说明在ESCC细胞中LASP1是miR-377-3p的直接靶基因。

图4. 双荧光素酶报告基因实验证明miR-377-3p与LASP1结合。（A）LASP1的双荧光素酶报告基因质粒突变位点。（B）双荧光素酶报告基因实验检测野生型LASP1和突变型LASP1分别与miR-377-3pmimics共转染后的荧光素酶活性。**P < 0.01。

3讨论

miR-377-3p作为抑癌基因参与多种肿瘤的调控[5-6]。本研究发现miR-377-3p在不同的食管癌细胞系中的表达均明显低于在正常食管细胞中的表达，在70例ESCC患者癌组织中miR-377-3p的表达较癌旁组织明显降低，且在有淋巴结转移的癌组织中表达明显低于无淋巴结转移的癌组织。在miR-377-3p的表达与临床病理特征相关性分析中发现miR-377-3p的表达与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期呈负相关。以上数据证明miR-377-3p有可能成为ESCC一个重要预后指标。

我们前期研究已经证实在ESCC组织和细胞中circ_0072088高表达，且circ_0072088可海绵吸附miR-377-3p，这也许是ESCC中miR-377-3p表达降低的原因，circ_0072088吸附miR-377-3p后调节VEGF表达促进食管癌细胞增殖、迁移和侵袭[7]，那么miR-377-3p是否能够通过其他途径影响ESCC的增殖、迁移和侵袭的呢？通过生物信息学预测分析及查阅相关文献我们发现除了VEGF外，LASP1也是miR-377-3p的下游靶基因。

LASP1可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及血管生成等[8]。有研究发现LASP1 蛋白在ESCC组织和细胞中均高表达，抑制LASP1后ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低[9]。

本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实了在ESCC细胞中miR-377-3p与LASP1之间可直接作用。降低miR-377-3p表达后LASP1蛋白表达水平明显升高，升高miR-377-3p表达后LASP1和p-AKT蛋白的表达明显降低。说明LASP1是miR-377-3p下游的靶基因。

综上所述，本研究中miR-377-3p在ESCC组织中和细胞中的表达水平降低，在有淋巴结转移的癌组织中表达明显低于无淋巴结转移的癌组织，miR-377-3p的表达与食管癌患者的肿瘤大小、TMN分期及淋巴结转移呈负相关。miR-377-3p可以通过靶向LASP1进而抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。综上所述，miR-377-3p有可能作为食管癌的预后评估指标及治疗靶点。

经费说明：本研究获得江苏大学附属人民医院研究基金（批准号：Y2020001、Y2019015）资助。

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*通讯作者: 施益军. Email:shiyijun@126.com