高效液相色谱法同时测定丹珍头痛胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量

高效液相色谱法同时测定丹珍头痛胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量

张传平

重庆市涪陵食品药品检验所，重庆，408000

摘要目的：建立高效液相色谱法测定丹珍头痛胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量。方法：色谱柱为Agilent  ZORBAX  SB C18柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1三氟乙酸溶液（42:58），流速为1.0mL/min,检测波长330nm。结果：质量浓度范围在4.433～88.65μg/mL的绿原酸与峰面积呈现的线性关系良好（r=0.9993），平均回收率为99.26%，RSD为0.24%(n=9) ；质量浓度范围在10.27～205.3μg/mL的迷迭香酸与峰面积呈现的线性关系良好（r=0.9991），平均回收率为99.11%，RSD为0.63%(n=9)。结论：该方法简单、准确、重复性好，可用于丹珍头痛胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量测定。

关键词：丹珍头痛胶囊；绿原酸和迷迭香酸；液相色谱法

丹珍头痛胶囊是由高原丹参、夏枯草、熟地黄、菊花等12味中药组方而成的复方制剂，具有平肝熄风、散瘀通络、解痉止痛的功效，用于肝阳上亢，瘀血阻络所致的头痛，背痛颈酸，烦躁易怒[1]。夏枯草具有清肝泻火，明目，消肿散结的功效[2]，为该方的臣药，菊花具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效[2]，为该方的佐使药，现行丹珍头痛胶囊标准中对上述两味药既无薄层鉴别，也无含量测定质量控制手段。为了更好的控制该品种的质量，笔者建立了高效液相色谱法同时测定丹珍头痛胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量，为该制剂建立完善的质量标准及标准提高提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦仪器公司）；梅特勒-托利多XPE205型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器公司）；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂：绿原酸对照品（批号110753-202018，纯度为96.1%，购自中国食品药品检定研究院）、迷迭香酸对照品（批号111871-201706，纯度为90.5%，购自中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯(购自成都市科龙化工试剂厂)；阴性对照溶液自制；丹珍头痛胶囊为市售品（批号：20210101、20210307、20210615）。

2 方法与结果

2.1色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为Agilent  ZORBAX  SB C18柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1三氟乙酸溶液（42:58），流速为1.0mL/min,检测波长330nm；柱温为30℃；进样量为10μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备：

精密称取绿原酸对照品0.01845g（含量以96.1%计），置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为354.61μg/mL的对照品贮备液，备用。

精密称取迷迭香酸对照品0.02269g（含量以90.5%计），置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为821.38μg/mL的对照品贮备液，备用。

分别精密吸取上述对照品贮备液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL，分别置5个20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品系列标准溶液。

2.2.2供试品溶液的制备：精密称取本品内容物细粉4.8356 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，称定重量，于KQ-500型超声波清洗器中超声处理（功率300 W，频率45kHz）30分钟，冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.3阴性样品溶液的制备：取缺夏枯草、菊花的丹珍头痛胶囊组方药材，处方比例不变，照丹珍头痛胶囊的制备工艺及“2.2.2”供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.3方法学考察

专属性试验：精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，照“2.1”液相色谱条件测定。结果，供试品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图色谱峰保留时间相同的位置上出现保留时间一致的色谱峰，阴性样品溶液色谱图中，在与供试品溶液色谱中绿原酸峰和迷迭香酸峰相应保留时间位置上未见色谱峰，说明其他药材对目标化合物的测定无干扰。色谱图见图1。

A

B

C

A. 对照品溶液  B. 供试品溶液  C.缺丹参阴性样品溶液
图1高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取混合对照品系列标准曲线溶液各10μL注入液相色谱仪，横坐标（X）为浓度, 纵坐标（Y）为峰面积，以实测值制作标准曲线，得绿原酸回归方程为Y=23.59X+28.43，r=0.9993（n=5），结果表明，质量浓度范围在4.433～88.65μg/mL的绿原酸与峰面积呈现的线性关系良好。

得迷迭香酸回归方程为Y=32.46X+24.38，r=0.9991（n=5），结果表明，质量浓度范围在10.27～205.3μg/mL的迷迭香酸与峰面积呈现的线性关系良好。

精密度试验：精密吸取绿原酸浓度为35.461μg/mL的对照品溶液5μL，连续测试6次，以峰面积来计算RSD，绿原酸峰面积的RSD值为0.64%(n=6)；精密吸取迷迭香酸浓度为82.138μg/mL的对照品溶液5μL，连续测试6次，以峰面积来计算RSD，迷迭香酸峰面积的RSD值为0.72%(n=6)，表明设备运行良好，精密度符合要求。

稳定性试验：取同一供试品（批号：20210101），于制备后0、2、4、8、12和24 h，按照“2.1”项下色谱条件进样测试，测定绿原酸和迷迭香酸的峰面积，考察其稳定性，结果绿原酸峰面积RSD值为0.57%(n=6)、迷迭香酸峰面积RSD值为0.66%(n=6)，表明在常温条件下，供试品溶液在24 h内相对稳定。

重复性试验：取同一供试品（批号：20210101），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件，按外标法以峰面积计算，测得绿原酸的平均含量为：0.457mg/g, RSD值为0.53%(n=6)；迷迭香酸的平均含量为：0.828mg/g, RSD值为0.49%(n=6)，表明该方法的重复性符合要求。

加样回收试验：取已知含量的供试品（批号：20210101）9份，每份1 g，精密称定，每3份1组，分别加入绿原酸和迷迭香酸对照品贮备液（低浓度组：加1.0 mL；中浓度组：加2.0 mL；高浓度组：加3.0mL），再按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见下表。

表1 绿原酸加样回收率试验结果（n=9）

表2 迷迭香酸加样回收率试验结果（n=9）

2.4 样品测定

取供试品3批（批号：20210101、20210307、20210615），按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定丹珍头痛胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量。结果见表4。

   表3 样品含量测定结果

3讨论

本实验考察振摇提取、超声提取和加热回流等提取方式对绿原酸和迷迭香酸提取率的影响，发现同一时间段内从经济效率因素考虑超声提取方式效率较高。

本实验还考察了提取时间对提取效率的影响。选取15、20、30及60分钟4个时间段对提取率进行考察，结果15、20分钟时提取率稍低，30及60分钟无明显差异，故选择超声提取30分钟。

本实验还参照文献[2]考察甲醇和稀乙醇提取溶剂的提取效率，发现同一时间内稀乙醇的提取效率高。

本实验对丹珍头痛胶囊中的绿原酸和迷迭香酸进行提取并采用高效液相色谱法进行含量测定，方法简便、快速，结果准确，分离效果好，专属性强，重现性好，可作为丹珍头痛胶囊的质量控制方法。

参考文献：

[1] 国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10633(ZD-0633)-2002-2012Z.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2020：78.

作者简介：张传平（1986-）男

，大学本科，主管中药师，主要从事药品检验工作。