亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定中草药保健食品中总黄酮的含量

亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定中草药保健食品中总黄酮的含量

叶月庆, ,廖景怡, 何艳兰

无限极(中国)有限公司 广东 江门529100

摘要：目的：采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定一款含有杜仲、黄芪、川芎和牛膝等中药材成分的片剂中的总黄酮含量。方法：以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色，在504nm处测定吸光度，计算片剂中总黄酮含量。结果：芦丁在浓度148µg -592µg内，吸光度与浓度成良好线性关系，回归方程：Abs= 0.0011*C+0.0104，R2=0.9990，平均加标回收率为98.0%，RSD为2.0%。结论：亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定含有杜仲、黄芪、川芎和牛膝等中药材成分的片剂中的总黄酮含量，该方法重复性好，结果准确。

关键词：硝酸钠-硝酸铝；中草药；保健食品；总黄酮；含量测定；

目前，总黄酮含量测定方法主要有紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法及近红外光谱法等［1］。中草药总黄酮的测定方法又细分为紫外直接测定法、NaNO3-Al(NO3)-NaOH显色法、AlCl3显色法、示差分光光度法等［2］，本文片剂中的总黄酮功效成分由杜仲、黄芪、川芎和牛膝等多种中药材提供，其中杜仲、黄芪为主。查阅相关文献资料，杜仲［3］和黄芪［4］总黄酮含量多以紫外分光光度法为测定方法,而紫外分光光度法是目前使用最为广泛,设备简单、适用性广、准确度和精密度较好等特点，对总黄酮含量分析中发挥着重要作用［1］，本文结合《保健食品功效成分检测方法》中总黄酮的分光光度测定法［5］，以亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定含有杜仲、黄芪、川芎和牛膝等中药材成分的片剂中的总黄酮含量，作为以中药总黄酮为功效的片剂的质量控制研究提供参考。

1实验材料、试剂及仪器

1.1实验材料

一种含有杜仲、黄芪、川芎和牛膝等含有黄酮类成份的中药材片剂，粉碎后备用。

1.2 实验仪器

紫外分光光度计、离心机、水浴锅、超声波清洗器、涡旋振荡器。

1.3 实验试剂及配制

实验用水为双蒸水，所用试剂为分析纯级。

硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、聚酰胺树脂（80～100目）。

芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）。

1.4 实验过程

1.4.1标准曲线的制备

精密吸取芦丁对照品溶液0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL（相当于芦丁0µg、150µg、225µg、300µg、375µg、450µg、525µg、600µg），分别移入10mL容量瓶中，加70%乙醇至5mL，各加 5%亚硝酸钠溶液0.4mL，摇匀，放置 6min；加入10%硝酸铝溶液0.4mL，摇匀后放置 6min；加 2mol/L氢氧化钠溶液3mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置35min；以零管为空白，在504nm处测定吸光度，以芦丁含量 (µg)为横坐标、吸光度值(A)为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.2 样品的制备

取片剂20片，研磨成均匀细粉末，称取2.0g粉末置25mL容量瓶中，先加少量70%乙醇充分振摇使其分散再加至20mL，超声30分钟，涡旋振荡30～60min放至室温，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，离心，取上清液过0.45µm微孔滤膜，弃去初滤液，留取续滤液。

精密量取续滤液7mL上内径为1.5cm的聚酰胺树脂柱子，待上样液完全进入聚酰胺柱后，用70%的乙醇以 1.5BV/h流速洗脱，自上样洗脱开始，前12mL置换液弃掉后，收集50mL洗脱后的溶液置于50ml容量瓶中，即为供试品溶液。

1.4.3 测试步骤

精密移取 5mL供试品溶液至10mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.4mL，摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝溶液 0.4mL，摇匀后放置6min；加 2mol/l氢氧化钠溶液3mL，用 70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置35min，在504nm处测定吸光度；以同法操作但不加硝酸铝的供试品溶液为样品空白，测定样品空白吸光度，以样品吸光度减去空白吸光度，所得差值为供试品溶液吸光度，依标准曲线计算出供试品中芦丁的含量。

2.结果与讨论

2.1标准曲线绘制吸取芦丁对照品溶液（148µg/mL）0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL（相当于芦丁0µg、148µg、222µg、296µg、370µg、444µg、518µg、592µg）七个浓度点。由表-1及图-1可知，芦丁在浓度148µg -592µg内，吸光度与浓度成良好线性关系，标准曲线回归方程：Y= 0.0011*X+0.0104，R2=0.9990。

表-1总黄酮标准曲线数据

图-1线性图

2.2样品取样量选择分别称

1.8g，2.0g，2.2g试样，按照样品的制备方法和测试条件进行测定总黄酮含量，RSD=1.8%，说明在1.8g~2.2g之间的取样量对总黄酮测试结果影响不明显。

2.3超声时间的选择称取2.0g试样置25mL容量瓶中，先加少量70%乙醇充分振摇使其分散再加至20mL，分别超声 25分钟，30分钟，35分钟，其它过程按照样品的制备方法和测试条件进行测定，RSD=2.8%，说明在25min~35min的超声时间内对总黄酮测试结果影响不明显。

2.4 70%乙醇洗脱液时收集的洗脱液量选择   称取 2.0g试样置 25mL容量瓶中，先加少量70%乙醇充分振摇使其分散再加至20mL，超声30分钟，定容，过滤,，取滤液过柱子，分别收集的洗脱液 45mL，50mL，55mL，其它过程按照样品的制备方法和测试条件进行测定,RSD=1.8%，说明70%乙醇洗脱液时收集的洗脱液量在45mL~55mL内对总黄酮测试结果影响不明显。

2.5待测溶液的放置时间选择  称取2.0g试样置25mL容量瓶中，先加少量70%乙醇充分振摇使其分散再加至 20mL，分别超声25分钟，30分钟，35分钟，其它过程按照样品的制备方法和测试条件进行测定，RSD=1.8%，说明待测溶液的放置时间在25min~45min内对总黄酮测试结果影响不明显。

2.6专属性实验以空白样品和空白100%加标测试，测试结果见表-2，空白样品100%加标回收率平均回收率为 99.91%，表明此方法专属性良好。

2.7加标回收实验精确称取2g样品（平行称取9份），分为3组，每组3份，并按样品含量的80%、100%、120%量进行加标（每组三平行），按照样品的制备方法和测试条件进行测定，总黄酮回收率在95.9-99.7%，表明该方法准确度良好。

2.8重复性实验取同一批次样品，进行6次平行实验，测定总黄酮含量，结果RSD=2.0%，表明该方法重复性良好。

2.结论

本文采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法对含有杜仲、黄芪、川芎和牛膝等含有黄酮类成分的中药材片剂总黄酮的含量测定，结果体现出良好的准确度、精密度、专属性和耐用性，线性合适，适合杜仲、黄芪、川芎和牛膝等含有黄酮类成份的中药材片剂中的总黄酮含量的测定，为含黄酮类化合物中药的质量控制提供有力的方法支撑。

参考文献

［1］包强.刘丽海.王延玲.毕映燕.中药材有效部位总黄酮含量测定方法研究概述［J］.中国中医药信息杂志,2018.4,25(9).

［2］张敏.李志英.不同中药总黄酮含量测定方法的选择研究［J］.海南师范大学学报（自然科学版）,2017.9,30(3).

［3］邓素兰.余继宏.管林.杜仲不同部位总黄酮含量的测定［J］.生物质化学工程,2007.5,41(3).

［4］何艳.陈华国.赵超.周欣.王垄.申海艳.黄芪颗粒中总黄酮的含量测定［J］.广州化工,2012.4,40(8).

［5］白鸿.《保健食品功效成分检测方法》中国中医药出版社 2011年版中“总黄酮的分光光度测定法.