隐匿性乙型肝炎病毒感染及血清学检测研究进展

【摘要】隐匿性乙型肝炎感染（Occult Hepatitis B infection，OBI）是HBV感染的一种特殊形式，它是指HBsAg阴性但肝组织或血清中能持续检测到相应载量的乙型肝炎病毒或共价闭合环状DNA(cccDNA)的状态。OBI的发病机制目前尚不明确，可能与基因突变、病毒载量低、表观遗传调控、免疫复合物的形成等有关。OBI在全球范围分布，主要受地区、患者特征差异、诊断技术的影响，不同地区、不同国家OBI的流行率有明显差异。2016年，世界卫生组织采取了到2030年消除病毒性肝炎的战略，世界卫生组织的目标是到2030年将肝炎发病率减少到90万例，并将每年因肝炎导致的死亡人数从140万减少到50万，但目前发现和治疗OBI的困难对这一目标提出了挑战。OBI是一个普遍存在但容易被忽视的问题，过去数十年间，随着血清学及病毒学检测技术的发展，对OBI的认识有了较大提升，然而仍有疑惑未得到解决，有待进一步研究。本文对隐匿性乙肝（OBI）的定义、诊断方法学、流行病学特点及临床意义进行系统阐述。

【关键词】隐匿性乙型肝炎感染（OBI）；HBV DNA；基因检测；血清学标志物

1 OBI的定义

隐匿性HBV感染（OBI）于1978年首次报道。2018年，一组专家在意大利陶尔米纳召开了一次共识会议，他们回顾并更新了隐匿性乙型肝炎感染（OBI）的最新进展。“隐匿性”乙型肝炎感染是指在血液中存在或不存在HBV DNA的情况下，在通过现有检测评估的血清HBsAg阴性的个体中，肝脏中存在具有复制能力的HBV DNA。在OBI中，由于宿主免疫或表观遗传控制，HBV DNA（以外体共价闭合环状DNA（cccDNA）的形式）处于低复制状态^[1]。因此，当检测到血清HBV DNA时，它总是处于低病毒血症范围，即e<200 IU/ml，只能间歇检测。OBI血清学在实践中，HBV暴露的血清标志物用于定义不同类型的OBI，可分为血清阳性或血清阴性。血清阳性OBI即血清中可检测到HBV核心抗原抗体（抗-HBc）和/或HBsAg抗体（抗-HBs），占所有OBI病例的80%，血清阴性OBI中两种抗体的缺失使得血清HBV DNA成为唯一可检测的标志物，使得诊断更具挑战性。

2 OBI的诊断

OBI的诊断是基于在HBsAg阴性个体血清中检测到HBV DNA或肝组织中检测到具有复制能力的HBV DNA，即cccDNA。结合OBI的定义，可以发现检测肝组织中的cccDNA是一个最直接的方式，但由于肝穿刺难以大规模推广以及目前国内外尚无标准化的检测方法，因此，检测血清中的HBV DNA是一种更加常用的方法，包括:实时PCR(real－time polymerasechain reaction，real－time PCR)及巢式PCR(nested polymerase chain reaction，nested PCR)。最重要的是，为了在献血、组织或器官移植的情况下确定潜在的血清阳性OBI受试者，以及当必须开始免疫抑制治疗时，可以使用抗-HBc检测作为OBI诊断的替代标记^[2]。

2.2检测方法学

OBI检测中S区的逃逸突变是OBI检测的主要挑战。如果HBsAg检测灵敏度不足或无法检测到该区域的变异，通常会导致假阴性HBsAg结果，从而导致错误诊断。HBV的分子检测也可能显示出不充分的敏感性。我们目前缺乏检测OBI的标准化和验证测试。一些研究试图基于内部测试来标准化这种检测，但其成功应用受到灵敏度和特异性变化的限制。缺乏敏感、特异、标准化和有效的OBI检测方法，导致不同人群对OBI的检测不足，使获得治疗变得复杂，并促进传播。考虑到OBI患者的血清HBV DNA浓度通常很低，并且可以间歇性地被发现，OBI的诊断需要在不同的时间点采集血样，并测试至少1mL血清或血浆中的DNA提取物^[3]。检测肝脏中具有复制能力的HBV DNA似乎是诊断的理想方法。然而，目前还没有经过内部和外部验证的标准化分析。推荐的方法是旨在扩增至少三个不同HBV基因组区域的巢式PCR技术、实时PCR技术或液滴数字PCR分析。

3隐匿性乙型肝炎的发病机制

目前隐匿性乙肝（OBI）的发病机制尚不明确，有学者认为隐匿性HBV感染是由HBV整合、HBV基因突变、PBMCs感染HBV及免疫复合物等多种因素造成。有研究表明急性肝炎HBs Ag转阴后10年以上，从患者的血清、肝组织或者外周血淋巴细胞中仍能检测到HBV DNA，但均处于较低的水平，并且体内一直存在较强的HBV特异性T细胞免疫反应^[4]。研究证明前S/S区的变异影响HBV膜蛋白的表达从而降低HBs Ag的检出率。另一项研究发现X基因区变异改变X蛋白等减少HBV的复制，HBV DNA的甲基化以及ccc DNA上组蛋白的乙酰化调控HBV的复制和表达，使表达HBsAg的基因沉默，这些突变的附加效应可能抑制病毒复制能力。

ＺＨＡＮＧ等将ＯＢＩ序列与ＨＢｓＡｇ阳性无症状献血者中获得的大量基因型匹配序列进行比较，结果显示与非ＯＢＩ菌株相比，ＯＢＩ菌株的突变率较高，特别是在ｐｒｅＳ／Ｓ区域具有更高的突变率，这可能会导致ＨＢｓＡｇ的抗原性降低或ＨＢｓＡｇ产生和分泌受损。Calvaruso等人的研究显示影响OBI持续性的病毒因素包括主要发生在基因S和基因C（前核心/核心）的突变，这些突变导致活动性感染（HBsAg）和病毒复制（HBeAg）的标记物无法通过当前常规用于检测HBV的血清学检测检测到。S1前区和S2前区的核苷酸替换、缺失和插入可能与HBsAg的减少或不表达有关，并且仅在OBI患者的分离物中发现。OBI菌株S基因的高遗传变异性与体外细胞内和细胞外HBsAg产生的异质模式有关。与HBsAg细胞内滞留相关的三种新的OBI特异性突变M75T、Y100S和P178R的鉴定进一步支持了HBsAg分泌不足可能是OBI多因素发生的重要原因的假设^[5]。

4流行病学特点及临床意义

据信，世界范围内的OBI预警隐性乙型肝炎感染在全球范围内广泛分布，在HBV高风险人群和/或HBV感染高流行地区的人群中发病率较高。各种因素可能影响观察到的患病率，包括存在风险组、抽样方法、所用检测的敏感性以及与地理区域相关的流行病学背景。OBI的流行病学OBI的全球流行病学变化很大，因为它取决于许多因素，如HBsAg和HBV DNA检测的敏感性，是否存在HBV暴露的风险因素，不同地理区域普通人群中HBV的流行情况，不同国家的抗HBV疫苗接种计划，以及受检人群中肝脏疾病的存在和严重程度。OBI在全球范围分布，主要受地区、患者特征差异、诊断技术的影响，不同地区、不同国家OBI的流行率有明显差异，其范围从0.68%~30%不等^[6]。在HBV高流行区，OBI的流行率也高；在合并慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染、免疫抑制、有HBV感染家族史、血液暴露等的人群中OBI的流行率较高。因人类免疫缺陷病毒(human immun-odeficiency virus,HIV)感染者、恶性肿瘤化疗后、器官移植患者处于免疫抑制状态，OBI的发生率也高；研究发现艾滋病患者中OBI发生率为25.4%(65/272)；M.BAGHBANIAN等发现204例恶性肿瘤患者中发生OBI 9例，且与其他实体肿瘤相比OBI在血液系统肿瘤中更常见；此外，Z.ZHANG等研究显示，白血病患者OBI感染的患病率高于对照组(10.5%vs2.9%)。对献血者进行HBsAg筛查后，输血后HBV感染率已大幅下降，但因OBI的存在，HBV通过血液在献血者与受血者之间仍有传播的潜在风险；与HBV密切接触的医务工作者亦有较高的OBI发生率在合并慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染、免疫抑制、有HBV感染家族史、血液暴露等的人群中OBI的流行率较高。OBI在慢性肝病患者中流行率较高，有研究表明:在HCV感染群体中达到15～33%，在隐源性肝硬化群体中达到32%，而在HCC患者中可能高达62%。OBI在有HBV感染危险因素的群体中的流行率表较高，对这部分群体需要进行定期筛查及监管。由于方法学的限制，OBI在一般人群中流行率尚不明确。

Shetty及其同事的一项前瞻性研究的发现，在美国慢性HCV感染的肝移植候选者中，隐性HBV感染的患病率相对较高，在OLT后8周时，13/22例患者血清中检测到低水平的HBVDNA，在24周时，7/22例患者中检测到了低水平的乙肝DNA^[7]。另一项研究表明，在接受抗-HBc阳性供体肝移植的受者中，22%至100%的受者发生了新发HBV感染。

HBsAg阳性的母亲所生新生儿免疫阻断后，尽管部分婴幼儿在第18周时血清学检测结果提示母婴阻断成功(即婴儿HBsAg阴性且抗－HBs阳性)，但血清中仍可检测到HBV DNA，建议连续随访至少至24月龄，若HBV DNA持续阳性，可考虑发生OBI。Hu An-qun等研究对母婴间显性和隐性乙型肝炎感染(HBI)情况进行调查,结果母亲HBI总患病率为12.1%(330/2,734),显性型为10.4%,隐性型为1.8%。在1 650对(20%)母婴传播中330对,Ⅰ型(从显性母亲到显性婴儿)、Ⅱ型(从显性母亲到隐性婴儿)和Ⅲ型(从隐性母亲到隐性婴儿)的总体传播率分别为1.9%(1/54)、5.6%(3/54)和0.0%(0/7)，说明过渡时期HBV主要由HBI母亲显性型向婴幼儿传播，对母亲加强产前筛查至关重要^[8]。

综上所述，根据OBI的特点，需加强对OBI高风险人群的筛查，主要对象为：有慢性或急性乙型肝炎病毒感染史者；合并HCV或HIV感染者；恶性肿瘤接受化疗或抗CD20治疗者；器官移植捐赠者和接受者；献血者与受血者以及医务工作者；血液透析患者；不明原因的肝脏疾病患者；母亲为乙肝感染的新生儿等。

OBI是一个普遍存在但容易被忽视的问题。过去数十年间，随着血清学及病毒学检测技术的发展，对OBI的认识日趋完善。然而仍有疑惑未得到解决:①尚无标准化检测方法，不同研究不能进行对比及组合；②需要高灵敏的检测方法来协助诊治；③不同地区不同人群的OBI流行率尚不明确；④OBI是否会、如何、在什么情况下导致和/或加重肝脏疾病尚不明确；⑤需进一步明确OBI的传播风险；⑥对于OBI群体的HBV再激活尚无通用的指南；⑦对于OBI的发生机制，仍需要进一步的研究。因此，对于OBI的研究依然任重而道远。

参考文献

[1]王成伟,咸建春.隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究进展[J].河北医学,2021,27(2):348-352.

[2]史宇晖,庄辉.隐匿性乙型肝炎研究现状[J].传染病信息,2005(03):97-99.

[3]Bes M，Vargas V，Piron M，et al.T cell responses and viral variability in blood donation candidates with occult hepatitis B infection.J Hepatol，2012，56（4）:765-774.

[4]陈建宏,刘妍,李进,等.隐匿性乙型肝炎病毒感染研究进展[J].实用肝脏病杂志,2015,18(2):205-208.

[5]occult hepatitis B:A systematic review and meta-analysis.J.Viral.Hepat.2022,29,317–329.

[6]何水珍,苏成豪,沈理通,等.厦门市自然人群中乙型肝炎病毒隐匿性感染状况调查[J].中华预防医学杂志,2015,49(2):132-136.

[7]Muñoz SJ.Use of hepatitis B core antibody-positive donors for liver transplantation.Liver T ranspl 2002；8:S82-7.

[8]王成伟,咸建春.隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究进展[J].河北医学,2021,27(02):348-352.