分子诊断技术结合传统分离方法在致泻性大肠杆菌检测中的应用

分子诊断技术结合传统分离方法在致泻性大肠杆菌检测中的应用

周旋

会东县人民医院 四川凉山 615200

【摘要】目的：探讨分子诊断技术结合传统分离方法在致泻性大肠杆菌检测中的应用效果。方法：选取2020年07月-2021年08月本院收集的600例患者的600份粪便样本为研究对象，通过传统分离法联合荧光PCR法对致泻性大肠杆菌（DEC）进行检测，分析其检出率及季节分布特点。结果：联合检测结果显示，DEC的检出率为19.17%，其他各种病原菌的检出率最高的是致病性大肠杆菌（EPEC），为8.17%，其次为EAEC，检出率为6.83%，EIEC检出率为2.50%，ETEC检出率为1.33%，无EHEC；6月份对DEC的检出率最高，7月次之；EPEC、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、聚集性大肠杆菌（EAEC）检出率最高的月份均是6月。结论：DEC联合应用传统分离法与荧光PCR法检测的准确率较高，DEC主要的病原菌是EPEC与EAEC。

【关键词】分子诊断技术；传统分离方法；荧光PCR法；致泻性大肠杆菌

致泻性大肠杆菌（DEC）也就是致泻性大肠埃希菌，是导致儿童及成人出现腹泻症状的重要病因。DEC根据其毒力特性、侵袭力可分为EPEC、EIEC、ETEC、EAEC及出血性大肠杆菌（EHEC）【1】。相关统计资料显示，DEC是引起患者死亡的重要病原菌，与普通大肠杆菌相比，DEC的表型与之无显著差别，通过常规的生化方法、血清培养等无法将之有效分离出来【2】。因此，基于突破DEC检测技术建立有效的DEC监测体系异常重要。本研究观察传统分离法联合荧光PCR法对DEC的检测效果，报道如下。

1  资料和方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本

选取2020年07月-2021年08月本院收集的600份粪便样本为研究对象，所有患者均伴有不同程度腹泻症状。

1.1.2 引物序列

结合GenBank公布的基因序列，通过Primer expressV3.0对taqman引物与探针进行设计，由上海辉瑞生物有限公司完成基因测序。

1.1.3 仪器与试剂

荧光定量基因扩增仪产自美国伯乐公司，型号为Rotor-gene 6000，加热模块产自英国TECHNI公司。所有试剂以及培养基等均完成质检并获得检验合格报告，探针与引物合成于Invitrogen公司，三塘铁生化管、探针反应液、麦康凯琼脂提供自上海市疾病预防控制中心，API20E生化板条产自法国生物梅里埃公司。

1.2 方法

在麦康凯平板上接种粪便标本，37℃环境下进行24h培养，通过200μL加样枪头对第一区刮取5cm长、3mm宽菌苔，将200μL的纯水加入进行菌液制备，在100℃环境下进行10min裂解后作为DNA模板。通过探针法检测基因，PCR初筛阳性标准为Ct值低于30。在麦康凯培养基上选取任一基因阳性样品优势纯菌落10个，分别在10支三糖铁琼脂中转种，挑取与 埃希菌属生化相符的菌苔实施阳性基因验证，纯克隆菌株也就是阳性管，最后通过API20E全面生化鉴定阳性株。对PCR扩增显示阳性的菌株通过不加探针的方式进行再次扩增及测序，在数据库中对测定结果进行比对。

1.3 观察指标

分析传统分离法联合荧光PCR法对DEC以及EPEC、EIEC、ETEC、EAEC、EHEC等其他病原菌的检出率。

2  结果

联合检测结果显示，DEC的检出率为19.17%（115/600），其他各种病原菌的检出率最高的是EPEC，为8.17%（49/600），其次为EAEC，检出率为6.83%（41/600），EIEC检出率为2.50%（15/600），ETEC检出率为1.33%（8/600），无EHEC病原菌。6月份对DEC的检出率最高，7月次之；EPEC、EIEC、ETEC、EAEC检出率最高的月份均是6月。

3  讨论

DEC与非致病大肠杆菌相比，两者在培养特性、形态以及生化特性等方面无明显区别，只能通过血清学方法并借助抗原性质对其加以准确区分。相关研究机构所公布的检测DEC的方法由血清凝集方面入手，结合国际公认的血清型对DEC加以分类，在确定血清型之后再实施毒力试验【3】。在上述检测过程中会耗费大量的人力物力，且检测步骤繁琐，阳性检出率也比较低，受上述因素影响对DEC检验产生较大阻力，其真实感染情况也难以准确评估出来。

随着近年来分子生物技术的飞速发展和日益普及，DEC被确认，各种基于DEC特异基因的相关PCR报道层出不穷，可以从基因层面上对DEC加以定义。将荧光PCR法与传统分离法相结合进行DEC检测，可迅速获取准确的诊断结果，最后获取的DEC毒株携带有目的基因【4】。另外，该联合检测方法具有极高灵敏度，可促使操作人员的工作效率有效提升，不仅可降低其工作强度，且省时简单，展现了其非常高的临床应有价值。本研究中，联合检测结果显示，DEC的检出率为19.17%，其他各种病原菌的检出率最高的是EPEC，为8.17%，其次为EAEC，检出率为6.83%，EIEC检出率为2.50%，ETEC检出率为1.33%；6月份对DEC的检出率最高，7月次之；EPEC、EIEC、ETEC、EAEC检出率最高的月份均是6月。提示该联合检查方法突破了血清凝集法与传统分离法检测DEC零阳性率的局面，并且检测结果显示疾病的高发期在6月，具有较为明显的季节性分布特征，与腹泻流行病学基本相符，值得进一步推广应用。

综上所述，DEC联合应用传统分离法与荧光PCR法检测的准确率较高，DEC主要的病原菌是EPEC与EAEC，可作为常规检测方法予以普及推广。

参考文献

[1]左秀华.多重PCR技术结合基因芯片检测致泻性大肠杆菌的研究[J].名医,2020(12):129-130.

[2]刘蕴博.实时荧光PCR检测腹泻患者肠致泻性大肠杆菌的分布情况研究[J].中国实用医药,2021,16(12):210-212.

[3]蒋艳凤.致泻性大肠杆菌分子生物学快速检测方法及其应用[J].中国保健营养,2017,27(6):371-372.

[4]谭寅凤.分子诊断技术结合传统分离方法在致泻性大肠杆菌检测中的运用分析[J].临床检验杂志：电子版,2020,9(3):248-248.