采用二代测序技术测量循环肿瘤DNA在肺腺癌复发监测和疗效评估中的原理和作用

采用二代测序技术测量循环肿瘤DNA在肺腺癌复发监测和疗效评估中的原理和作用

李嘉妮

青海省    格尔木市第一中学

【摘要】：癌症是现代比较棘手的疾病之一，其中肺腺癌的死亡率最高，究其根本是肺腺癌在早期不易被发现，导致病人感到身体不适的时候，肺腺癌已是晚期最后病人死亡。迄今为止，除了化疗和放疗对于癌症没有更好的治疗方法，而临床分期不能够否满足对肺腺癌的精准化治疗，靶向药的使用无明确的使用标准。手术后，癌症治疗的疗效评估没有，针对癌症复发的提前监测方案，也没有。本文旨在对实体瘤的基因突变种类的检测，更好的细化癌症的分类标准，进一步指导患者的治疗方案，评估复发时间。以实体瘤中检测出的突变为基础，采用二代测序技术（Next-generation sequencing），对外周血中循环肿瘤DNA（circulation tumor DNA, ctDNA）进行深度测序和实时监测。能够达到评估术后治疗疗效和复发风险，通过讲述经典的癌症抗原检测方法以及高通量测序技术来阐明ctDNA突变检出的原理。最后采用实体瘤的多个基因突变，分析出原发突变和继发突变以及产生肿瘤细胞演化的过程，以期对其进行不同时间的针对治疗。可通过ctDNA检测和突变的情况，来判断复发。

【关键词】：

肺腺癌，基因突变，循环肿瘤DNA（ctDNA）测序，复发，疗评 ，二代测序技术，抗原检测技术，苏木精伊红染色技术，免疫组织化学（IHC）染色技术

【前沿】：

1.小分子生物学

1.1基因突变

基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象（gene mutation）。在分子水平上指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。         基因突变又包含点突变和染色体畸变，而突变型一词既指突变基因，也指具有这一突变基因的个体。

基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期。同时基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义和科学研究在生产上的实际意义。

1.2基因突变的影响因素

既有外因也有内因，外因中物理因素：x射线、激光、紫外线、伽马射线等。化学因素：亚硝酸、生物因素：某些病毒和细菌等都会对基因突变造成影响。DNA复制过程中，基因内部的脱氧核苷酸的数量、顺序、种类发生了局部改变从而改变了遗传信息也可能对基因突变产生影响。

1.3循环肿瘤DNA（ctDNA）测序

正常细胞和肿瘤细胞都会破裂，细胞破裂之后，细胞中的DNA会被释放到体液当中，其中进入血液当中的DNA被称为血液游离DNA，也被称为血浆游离DNA，简称cfDNA（cell free DNA）这些DNA的长度主要集中在100BP-240BP之间，大部分在170BP左右。而ctDNA测序技术是将血液当中游离的DNA 提取出来，建成DNA测序文库，用探针杂交，PCR扩增等方法，把其中与肿瘤相关的DNA富集出，进行高通量测序，再进行数据分析，用来观察基因的突变，接着根据基因突变的信息决定下一步的治疗方案。

【注意】在全部的cfDNA中ctDNA只占一小部分，大约只有千分之几到万分之几其余都是正常的DNA，在癌症早期，ctDNA的含量占全部cfDNA的比例更小，而癌症后期ctDNA的含量占全部cfDNA比例更高。在血液当中cfDNA的含量很少，大约每一毫升的血浆中，只含有十个的纳克（ng）的cfDNA。

2.肺腺癌

2.1癌症的本质和分期

      癌症又可以称为恶性肿瘤，主要是以异常细胞（指这种细胞分化和增值不受控制，并具有浸润和破坏正常人体组织的能力的细胞。）的发展为特征。癌症的发与多种因素有关，一般临床上可分为致癌，促癌，和演进三个过程。据世界卫生组织统计，成年人最常见的恶性肿瘤包括肺癌，大肠癌，胃癌，肝癌和乳腺癌。在儿童中最常见的癌症是白血病，脑肿瘤，和恶性淋巴瘤。目前临床治疗手段为手术，化学药物治疗，放射性物质治疗。癌症的分期方法很多，但最常见的还是使用世界卫生组织建议的分期方法，简称TNM（T是指肿瘤的大小范围，肿瘤在粘膜和肿瘤在粘膜下称作T1，肿瘤组织涨到肌层成为T2，到肌层外的浆膜层就称作T3，当长到邻近的组织就称作T4。N主要是指淋巴结，存在淋巴结转移的时候，就成为N1,N2甚至N3，判断依据主要是根据淋巴结转移的范围而定。M就是当肿瘤向远处转移时称为M1，没有向远处转移称为M0）。

根据这几种组合，将癌症分为Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期，和Ⅴ期，也可以称为早期，中期和晚期。而分期也决定了治疗的手段和方案，Ⅰ期和Ⅱ期通常考虑手术治疗，Ⅲ期时手术治疗基本上失去意义，一般给予放疗或者化疗，Ⅳ期病人已经出现肿瘤向远处转移，一般会以全身治疗为主（全身治疗指全身放疗，免疫治疗，靶向治疗，中医药治疗等方法。）Ⅴ期病人肿瘤发生全身性的转移，此时放疗和化疗只能起微小的作用，基本上98%的Ⅴ期癌症患者最终会死亡，只有2%的患者能够存活。

2.2肺腺癌的临床表现

     肺腺癌的临床表现很多，一般分为以下几种

1. 原发肺部癌灶的症状，即咳嗽，咳痰，胸痛，胸闷，气喘，咳血等。
2. 原发癌灶侵犯周围组织的症状，上腔静脉压迫症状例如面部水肿，病人眼睑下垂，喉返神经侵犯症状如声音嘶哑，心包侵犯症状如心悸、呼吸困难、口唇紫绀；
3. 远处转移症状，脑转移如头晕、头痛、恶心、呕吐、视力下降、意识障碍、肢体功能障碍等，肝转移如肝区疼痛、腹胀、黄疸等，骨转移如骨痛、骨折的相关症状，脊柱转移者严重时会出现截瘫；
4. 癌症全身症状，即乏力、消瘦、发热、贫血等。

总之，肺腺癌症状很多，早期症状轻，随病情进展，症状会逐渐加重。

2.3肿瘤组织切片观察

通过石蜡包埋和石蜡切片的方法获取组织切片后通过苏木精伊红染色技术，观察肿瘤组织切片。

2.4苏木精伊红染色（H&E染色）原理

    苏木精是碱性染料，主要染核DNA，经过苏木精染色，可以较明显的观察到细胞核。伊红是细胞质染料，会将细胞质染成粉红色，便于观察细胞的形态和结构。癌症的细胞在经过苏木精伊红染色后，可以清楚的观察到，癌症细胞具有多核，有很少的细胞质结质，且不规则的特点。

2.4.1 苏木精伊红染色（H&E染色）技术

   一. 将切片放入二甲苯溶液中2分钟，放入1：1二甲苯加无水酒精中5分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，95%酒精2分钟，80%酒精2分钟，70%酒精2分钟，蒸馏水中清洗2分钟。2.接下来进行苏木精染色，将切片放置苏木精染液染至15-20分钟，用自来水冲洗干净（注：水流要沿着染缸侧面流入，不能够过急，避免冲掉玻片上的组织）3.进行分化，将切片放入1%盐酸酒精溶液当中分色30-60秒，去除细胞核不想染色的部分，仅仅保留合理的染色部分。4.蓝化，将分色的切片用自来水冲洗15分钟使之变蓝，在显微镜下观察细胞核染色情况，若细胞核褪色过多，可再次返回苏木精溶液，重新染色。5.伊红染色，将切片放入水伊红染液，染色2分钟，使胞质中的碱性成分，染成粉红色，使用自来水冲洗干净然后放入蒸馏水中。6.脱水透明，将切片依次放入70%酒精2分钟，80%酒精2分钟，95%酒精Ⅰ2分钟，95%酒精Ⅱ2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ2分钟，二甲苯Ⅱ2分钟。至此苏木精伊红染色（H&E染色）结束。

3. Sanger测序

   Sanger法测序的原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基因，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

   目前Sanger测序技术已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。如p53基因、BRCA基因、APC基因的检测分析，可用于早期发现某些肿瘤的易感人群，如：乳腺癌、结肠癌，对这些人群采取必要的生活方式调整、早期诊断及其它干预措施，从而达到预防医学治未病的效果。Sanger测序可以助力癌症病人个性化用药，应用Sanger测序法对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测，结果直观、可靠。且Sanger 测序检测不同个体细胞色素P450耐药性基因，可以确定不同人对药物的敏感性和耐受程度，是个人用药剂量确定的重要依据。

4.二代测序技术

4.1.1二代测序技术原理

  第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgun method）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。

4.1.2 文库制作构建

  文库构建即为测序片段添加接头。无论是PCR产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接扩增和测序。DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。下面通过实验阐述文库构建的操作和原理：

①末端修饰。目前很多PCR使用的高保真Pfu聚合酶产生的片段末端是平齐的）；鸟枪法产生的片段则是随机断裂，其末端可能是平齐的也可能是不平的。因此，建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）。

②添加接头。经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。NEB的接头为特殊的碱基U连接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头。这一步添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列（此外还作为测序引物Rd1 SP/Rd2 SP），而之所以为“Y”型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1 SP与Rd2 SP交错），因为连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出的T来与DNA连接，“Y”接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而在后续PCR中可以连接不同的寡核苷酸序列

③磁珠纯化。添加接头后的文库体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自连片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。其原理为磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面含有20%的PEG 8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。因此磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（其实是PEG添加量）来实现片段选择。

④PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增。这个过程非常重要，因为目前所有片段其两端是不互补的Y形结构，不能直接进行测序；此外，片段还需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列。

⑤第二次磁珠纯化。PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化，之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。

测序是以单链为单位的，建库完成后的每条DNA的单链均一端连有测序引物Read1 Sequencing Primer（Rd1SP）和P5，另一端为Rd2 SP、Index（Barcode）和P7。Index用来区分不同的文库，因为测序仪一个run产生数据量巨大，由于实际情况不同，一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上Index来区分。

同时在建库过程中，文库中每个DNA短片段的正链与反链都加上了P5与P7，因此建库后每个DNA片段都会扩增出两种结果，如果全部上机，最终两条链都会有测序结果。因为上机测序起始是以DNA单链为单位，单链化的DNA片段进入测序仪流通池，会随机的结合在不同位置，且相互距离足够远以保证测序信号的独立读取。最终获得的测序结果会有重复的reads(反向互补也会有重复)，所以都会有去重步骤，而且测序量越大重复率会越高。

5. 二代测序技术优势

二代测序一次能够同时得到大量的序列数据，相比于一代测序技术，通量提高了成千上万倍； 单条序列成本非常低廉。 缺点： 序列读长较短，Illumina平台最长为250-300bp，454平台也只有500bp左右。

二代测序相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，这也给三代测序提供了发展空间。

6.肺腺癌疗效评估

临床医生根据肿瘤治疗后的疗效反应来选择最佳的治疗方法。临床医生可以通过监测肿瘤附近血液当中的ctDNA，通过观察ctDNA的含量可以确定癌症治疗的疗效，通过二代测序技术，可以更深层的判断治疗疗效。也可以通过ctDNA的监测，判断癌症是否复发，进一步的确定治疗方案。

【总结】

  癌症是一直存在于人类当中，在癌症被定义前，癌症患者几乎只有死亡一条路，但近年来，随着科技的发展，应对癌症的治疗方法越来越多。化疗，放疗，手术治疗，靶向药治疗。在检测技术上也有大进步，Sanger测序，二代测序等。虽然目前已经可以较好的治疗早期的癌症，但是在癌症这个疾病上，还无法做到精准治疗，明确的治疗方案无法拟定，导致面对癌症患者时，医生只能凭借经验给出治疗方案，对患者身体伤害极大。未来在癌症治疗方面，还有很多的进步空间，科学家们在研究癌症的治疗方案为人类带来好处的同时也需要努力革新技术，以尽量避免其带来的风险和危害。

【参考文献】

[1]DNA测序技术方法研究及其进展.万方.2016-04-05

[2]新一代DNA治疗技术的应用与研究进展.万方.2019-02-26

[3]DNA测序技术进展及其应用.万方.2013-08-26

[4]DNA测序技术的发展历史与最新进展.万方.2010-09-18

[5]Helicos公司单分子基因测序仪.万方.2010-04-20

                                                                                 李嘉妮