不同负荷运动干预对骨骼肌细胞线粒体融合蛋白表达以及能量代谢水平的影响

 不同负荷运动干预对骨骼肌细胞线粒体融合蛋白表达以及能量代谢水平的影响

王晓娜

郑州工商学院

摘要：自线粒体发现至今，人们对其做了持续性的研究，取得了较为丰硕的研究成果。当前，关于线粒体融合分裂在功能层面的研究已经较为完善，但是对于其在机能和能量代谢方面的研究仍然不足。线粒体的融合与分裂作为一个整体性的进程，通过自噬功能对异常线粒体进行清理，实现线粒体功能状态的正常化，作为一项重要的生理性过程，线粒体融合是保持线粒体数量的重要前提，与能量代谢合成有着密切的关系。因此，观察不同负荷运动状态下机体骨骼肌细胞线粒体融合蛋白表达以及能量代谢水平，有助于更好的发现骨骼肌对运动的适应性，同时也进一步丰富了线粒体融合与运动和能量代谢之间的关系，从而对科学运动方案的制定以及运动损伤的减少和疾病康复夯实研究基础。

关键词：不同负荷；线粒体融合；能量代谢

1 研究目的

随着现代运动科学研究的不断深入，对线粒体在不同运动中的融合以及相关蛋白方面的研究愈加重视，但是结合当前各学者的相关研究不难看出，对于线粒体的研究多集中于融合与分裂的机能层面，对于运动中线粒体对骨骼肌的影响的研究相对不足。作为运动科学的研究热点，探究不同负荷运动条件下线粒体呈现何种影响机制，对于我们进一步研究运动对线粒体融合与分裂之间的关系，探究线粒体能量代谢及相关分子机制有着十分重要的作用。相关研究对于如何制定更加科学的运动方案从而减少运动损伤以及预防相关疾病的发生发挥着不可估量的价值。

2.实验材料与方法

2.1 实验对象与方案

本项目实验对象为健康雄性SD大鼠，大鼠购买于郑州大学实验动物研究中心，共购买50只。小鼠购回以后首先进行适应性饲养一周，适应性饲养期间小鼠正常饮食，自由运动，温度控制在22±2℃，适度控制在50%±10%。

在为期一周的适应性饲养过程中，有2只大鼠死亡，其余大鼠状态良好，随机选取其中40只作为本项目实现的实验对象。将40只大鼠随机分为4组，分别为安静对照组（c组，n=10）、低负荷运动组（L组，n=10）、中等强度有氧运动组（M组，n=10）和大负荷力竭运动组（H组，n=10），低负荷、中负荷以及大负荷组大鼠的最大摄氧量分别控制为40%±10%VO2MAX、60%±10%VO2MAX、80%±10%VO2MAX。其中安静对照组保持自由饮食，不参与任何运动干预，其余三组根据设置好的不同负荷运动进行为期6周的跑台运动。

项目运动方案为：在第一周低负荷运动组大鼠以每分钟3m的速度持续跑台30分钟，中等强度有氧运动组大鼠以每分钟10m的速度持续跑台30分钟，大负荷力竭运动组大鼠以每分钟18m的速度持续跑台30分钟。在第二至第四周各运动组大鼠每周炮台速度均在原有速度基础上增加2m，低负荷运动组以及中等强度有氧运动组每周运动时间增加10分钟，大负荷力竭运动组每周运动时间增加20分钟。在第五、第六周各组大鼠的运动速度均与第四周运动速度保持一致，在此过程中每周对大鼠的体重进行记录。

2.2 实验方法

2.2.1 HE染色法

从载玻片盒中取出装有载玻片的载玻架，并将其依次放入磷酸盐I缓冲液5min-磷酸盐Ⅱ缓冲液5min，然后取出组织用去离子水冲洗一次再次置入浓度为60%的医用酒精中5min-浓度为70%的医用酒精中10min-浓度为80%的医用酒精中2min-浓度为90%的医用酒精中1min-浓度为95%的医用酒精中1min-双蒸水2min。

将苏木精-伊红（HE）溶液置入染缸，将玻片放入染缸中浸染10min，取出浸染后的玻片用流水对其进行冲洗直至玻片上无颜色残留，使用酒精对其进行分化然后置入纯净水中反蓝，用镊子轻轻夹取玻片轻甩至玻片无残留水分，再将其装入HE溶液中，5min后使用流水去除浮色，进行HE染色。

将玻片置入浓度为90%的酒精溶液Ⅰ中1min，取出后置入浓度为90%的酒精溶液Ⅱ中1min，取出后置入无水酒精Ⅰ中10s，取出后置入无水酒精Ⅱ中15s，置入磷酸盐I缓冲液60s，取出后置入磷酸盐Ⅱ中60s，使其脱水透明。

将玻片置入通风橱柜中，从磷酸盐Ⅱ溶液中用镊子取出玻片，轻微甩动使其表面无残留水分，用吸管吸取树脂滴在玻片组织上，使用镊子夹取玻片覆盖并对其从中间部位进行轻轻按压排出拨片中的起泡，在室温环境中自然晾干，完成封片。将玻片置于电子显微镜下进行观察，并选取合适的角度拍照后保存完成图像采集。

2.2.2 酶指标测定法

本项目对酶指标测定主要包含以下几个方面：

（1）线粒体蛋白浓度的测定

线粒体蛋白分子的测定中，测定原理为考马斯亮蓝试剂室温下通常为棕红色，将其加入到蛋白质样品中，试剂中的阴离子与蛋白中的铵根离子相互反应使得常温中试剂中的颜色发生变化，变化为蓝色，辅以吸光度分析方式测算出线粒体蛋白的含量。

（2）线粒体三磷酸腺苷含量的测定

三磷酸腺苷与肌酸激酶发生反应，反应物为磷酸肌酸，磷酸肌酸可以用磷钼酸比色法测定三磷酸腺苷含量。在对组织样本的处理中，选取适量的股四头肌，使用电子秤对其进行称重，按照重量与去离子水1：9的比例混合，制成匀浆液，将匀浆液放入沸水中蒸煮越15min，混匀后放入高速离心机中离心15min，提取上清液待用。

（3）线粒体CYC氧化酶活性测定

生物细胞线粒体中均存在有CYC氧化酶，CYC氧化酶通过与氧化磷酸化反应从而为细胞产生能量支持，CYC氧化酶在反应系统中通过对CYC进行还原从而使得吸光度的下降，这也为比色法测定CYC氧化酶活性提供了重要途径。

（4）线粒体ATP合成酶活性的测定

线粒体ATP合成酶是线粒体氧化磷酸化反应的结果，使用活性光谱法以丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进行循环反应，从而对线粒体呼吸链复合物 V 水解产生的ADP，其中还原性NAD氧化后导致的吸光峰值降低，通过此原理使用光谱法对样品中的酶活性进行测定。

（5）线粒体CS活性的测定

CS是三羧酸循环的调控酶，起到氧化反应的作用，可通过比色法进行测定。

在具体的操作过程中，首先将测定的仪器、样本和试剂准备好，分别在阴性对照孔和样本孔中加入缓冲液；其次在其中加入适量的底物液；第三在每个孔中分别加入显色剂，放在摇床中使其充分均匀，在38摄氏度环境中进行孵育约5min；第四在阴性对照孔中加入阴性对照液，在样本孔中加入样本；第五将其放置于摇床晃动均匀然后放在酶标仪中测定样本的最初吸光度；第六将标板在38摄氏度环境中进行孵育约20min，然后放入酶标仪中测定样本的吸光度，根据公式测定线粒体CS活性。

2.2.3 蛋白免疫印迹测定法

首先是提取蛋白。将小鼠的股四头肌放在冰台上取适量，用剪刀将其剪碎，然后加入适量的RIPA Lysis Buffer，使用研磨器对组织进行研磨，待其充分裂解后置入高速离心机中离心10min，去除上清备用。

其次是对蛋白进行定量。在试管中加入适量的裂解液，加入适量的牛血清蛋白，将其放在摇床中使其充分均匀后配置为蛋白标准品并对其进行稀释备用；配备二辛可酸工作液，其中A/B液的比值为1：50，配置好二辛可酸工作液后避光保存备用；将不同量的蛋白标准品分别加入孔板的标准孔内然后在分别加入PBS缓冲液使其均达到20微升，配置为不同浓度的标准品备用；在孔板中分别加入不同浓度的样品，然后加入二辛可酸工作液，在38摄氏度的孵育箱中静置0.5h；使用酶标仪测定样品中的蛋白浓度。

第三是进行配胶。分别制备上下层的分离胶，其中上层分离胶制备浓度为5%，下层分离胶制备浓度为10%。

第四是进行电泳。配胶完成后将胶板长板朝外放入电泳槽，同时往密闭槽内倒入电泳液，胶孔内分别加入适量的待测蛋白，外电泳槽内加入电泳液，设置70V电压对其进行电泳，待其清楚后加压至110v。

第五是转膜。首先将转膜液放入低温冰箱制冷，根据胶规格裁剪与之匹配的PVDF膜，将PVDF膜放入羟基甲烷溶液待其激活PVDF膜；其次依照顺序将海绵、滤纸、胶、PVDF膜排列好并去除中间的气泡，以110v电压进行转膜。

第六，将转好的膜放入提前配置好的封闭液中封闭120min，让后将其置于摇床中充分摇匀。

第七对其孵育。等膜孵育完成后使用1倍的Tris-HCl缓冲盐溶液对其进行清洗15min，确保清洗完成后将其加入一抗并置于低温冰箱存放12h。等待一抗孵育完成后回收一抗，然后使用1倍的Tris-HCl缓冲盐溶液对其进行清洗30min，加入二抗在室温环境下孵育。

第八是显影。待孵育完成后回收二抗，使用1倍的Tris-HCl缓冲盐溶液对其进行清洗15min。配置显影液避光存储，显影板上放上条带并加入显影液待其曝光后显影，对显影的图片进行存储，使用显影分析软件对条带进行分析，通过灰度值观察蛋白的水平。

2.2.4 数据分析法

本项目中涉及的数据均采用SPSS21.0统计软件进行数据处理，以标准差±表示平均数。数据的统计方法采用单因素方差法进行分析，其中P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极为显著性差异。

3 实验结果

3.1 不同负荷跑台运动干预后大鼠体重的变化

安静对照组、低负荷运动组、中等强度有氧运动组和大负荷力竭运动组在经过为期6周的有氧运动干预后大鼠体重相较于实验前均有所增加，且呈现显著性的差异（P＜0.05）。通过组间对比发现，安静对照组在运动干预的前三周与实验前差异并不明显（P＞0.05），而其余三组在运动干预的第2周体重相较与实验前呈现出显著性差异（P＜0.05）。除了大负荷力竭运动组以外，其余二组运动组大鼠的体重均是随着训练干预的周期增加呈现不断上升趋势，大负荷力竭运动组在第6周大鼠体重呈现一定程度的下降。总的来看，在整个6周的运动干预后，对照组与运动组之间大鼠体重变化并不明显，均是随着时间的推移呈现一定的增加，且个之间大鼠体重没有显著性差异。

3.2 不同负荷跑台运动干预后大鼠腓肠肌苏木精-伊红染色结果

观察6周不同负荷跑台运动干预后大鼠腓肠肌苏木精-伊红染色结果，可较为直观的反映出大鼠骨骼肌形态学状态，有助于我们分析大鼠骨骼肌细胞质量的变化情况。图4-2是本项目对各组大鼠腓肠肌横切面的苏木精-伊红染色结果的电子显微镜观察图像。从图像中可以明显看出，经过苏木精-伊红染色，大鼠骨骼肌腓肠肌细胞质呈现粉红色，细胞核呈现蓝色。安静对照组细胞整体呈现多边形，且形状较为规则，细胞排列整齐，大小均匀，肌膜完整；低负荷运动组肌纤维相对安静对照组呈现较粗趋势，细胞核的数量有所增加；中等强度有氧运动组细胞排列较为紧密，体积略有增大；大负荷力竭运动组细胞间隙增大，虽然肌纤维结构完整但是排列不够紧密，呈现出炎细胞浸润现象。

3.3 不同负荷跑台运动干预后大鼠股四头肌生化法检测结果

在整个6周的运动干预后，对照组与运动组之间大鼠体重变化并不明显，均是随着时间的推移呈现一定的增加，且个之间大鼠体重没有显著性差异；股四头肌线粒体三磷酸腺苷含量变化情况中大负荷力竭运动组的三磷酸腺苷含量最高，其次是中等强度有氧运动组，再次是低负荷运动组，最后则是安静对照组；中等强度有氧运动组的股四头肌线粒体CYC 氧化酶活性最高，低负荷运动组的股四头肌线粒体CYC 氧化酶活性次之，大负荷力竭运动组的股四头肌线粒体CYC 氧化酶活性为运动组中最低，运动组的的股四头肌线粒体CYC 氧化酶活性虽然相较于安静对照组有所提升但是并不显著；中等强度有氧运动组和大负荷力竭运动组要略高于低负荷运动组但是并不呈现显著性差异。中等强度有氧运动组股四头肌线粒体三磷酸腺苷合成酶活性低于大负荷力竭运动组；相对于安静对照组，运动组3组的大鼠骨骼肌CS合成酶活性呈现不同程度的降低，由高至低分别为大负荷力竭运动组＞中等强度有氧运动组＞低负荷运动组。

3.4不同负荷跑台运动干预后大鼠股四头肌免疫印迹蛋白法测量结果

相较于安静对照组，低负荷运动组大鼠股四头肌线粒体视神经萎缩蛋白 1的蛋白表达有略微的下降趋势，而中等强度有氧运动组和大负荷力竭运动组则呈现一定的上升趋势，但是并无显著性差异；相较于安静对照组，大负荷力竭运动组大鼠骨骼肌线粒体分裂因子 1的蛋白表达有所提升且呈现非常显著性差异，低负荷运动组和中等强度有氧运动组则无明显差异；中等强度有氧运动组大鼠骨骼肌线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 IV的蛋白表达要显著高于大负荷力竭运动组，大鼠骨骼肌线粒体细胞色素 C 的蛋白表达中中等强度有氧运动组最高，大负荷力竭运动组则低于低负荷运动组且呈现非常显著性差异；运动3组的大鼠骨骼肌线粒体过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1a 的蛋白表达均有一定程度的提升，其中低负荷运动组和中等强度有氧运动组提升最为明显，运动3组的大鼠骨骼肌线粒体线粒体转录因子 A的蛋白表达均有一定程度的提升，其中中等强度有氧运动组提升最为明显。

4 研究结论

首先，对于线粒体能量代谢水平以及骨骼肌细胞能量代谢水平的运动影响方面，低负荷运动效果并不理想，中等强度有氧运动对于线粒体能量代谢水平有较好的提升，大负荷力竭运动则对骨骼肌细胞能量代谢水平有显著的改善作用。

其次，线粒体融合和生物合成能力的提升中等强度有氧运动发挥的作用最为显著，大负荷力竭运动虽然也在一定程度上提升了线粒体融合功能，但是线粒体分裂的加速作用同样不容忽视。

第三，实验结果并未发现骨骼肌能量代谢相关指标与线粒体融合蛋白表达之间存在明显的相关性。

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作者简介：王晓娜（1986—），女，中共党员，河南郑州，副教授，单位：郑州工商学院，硕士研究生，研究方向：体育教育训练学。

项目介绍：2021年度河南省科技厅科技攻关项目：不同负荷跑台运动对SD大鼠骨骼肌线粒体融合及相关蛋白的影响（'212102310267）