探讨免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中应用价值

探讨免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中应用价值

丛培杰,仲昭睿

赤峰市第二医院检验科，内蒙古赤峰市，024000

摘要：目的:传统的结核分枝杆菌鉴定方法时间长，灵敏度低，往往延误患者的诊断和治疗，随着分子生物学的迅速发展，本研究利用免疫荧光双重染色建立结核分枝杆菌的快速检测方法，节省宝贵的时间。方法：采用免疫荧光双重染色法检测可疑肺结核患者痰标本中核苷酸特异性片段，免疫荧光双重染色与传统诊断方法无区别。结果：发现80例疑似肺结核阳性病例，10例排除肺结核。80例疑似肺结核患者痰标本中，免疫荧光双重染色阳性率为87.50%，痰涂片阳性率为56.25%，痰培养阳性率为75.00%，免疫荧光双重染色阳性率高，差异统计00，（p < 0.01).结论：应用免疫荧光双重染色法对结核分枝杆菌患者的诊断敏感性和特异性均高于98.0%，提高检出率，为结核分枝杆菌肺炎的早期诊断提供一定依据。

关键词：免疫荧光双重染色；结核分枝杆菌；肺炎

引言

结核病是结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，仍然是威胁全球公共卫生的主要传染病。虽然结核分枝杆菌肺炎的免疫诊断在简便性、速度、敏感性和特异性方面具有很高的优点，主要依靠体液和细胞对结核分枝杆菌肺炎侵袭宿主的免疫反应，但很难确定感染的敏感性，随着医学技术的发展，免疫荧光的双重染色得到广泛应用，使人们能够根据试验对象的特点和试验的具体条件选择最合适的检测方法，并通过测量荧光强度确定样品中要测试的抗原含量，专门研究分析了免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者诊断中的应用，以促进免疫荧光双重染色的临床应用。提供了下列资料。

1资料与方法

1.1一般资料

中国疾病防治中心提供了结核分枝杆菌H37Rv型菌株，在赤峰市第二医院采集了细菌菌株和试管苗；种子和探针(表1)交付上海精工综合有限公司；DNA提取采用江苏硕世公司的磁珠提取试剂盒，从潍坊安普未来生物技术有限公司购买了双染色免疫荧光母系。栽培环境采用珠海北斗酸性岩石介质和中性岩石介质。

1.2方法

第二个样品采用免疫荧光双重染色法染色，其特点是绵羊和兔子用PPD多克隆抗体抗结核分枝杆菌，大鼠和携带Cy5的小鼠用ESA-T-6单克隆抗体。采用免疫荧光双重染色后，在激光扫描共用聚焦显微镜上观察，选择波长405nm和635nm的双荧光标记，同时接收双通道信号成像。所有测试结果均由检验科首席医生确定(服务年限≥10年，职称:中级及以上)。同时采集所有患者的第三个样本进行胸腔积液生化指标检测，包括胸腔积液腺苷脱氨酶（ADA）、乳酸脱氢酶（LDH）、总蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）等。

1.3观察指标

免疫荧光双重染色检测结果；痰涂片镜检结果；痰涂片镜检结果。

1.4统计学方法

采用SPSS21.0对研究对象采集的数据进行分析处理，计量数据采用(±s)表示；计数资料采用%表示，使用χ2对数据进行校检；P>0.05为差异无统计学意义。

2结果

2.1免疫荧光双重染色检测结果

如图1所示，在80个疑似结核病患者的筛查样本中，70个呈阳性。对13岁以下的10例患者进行了筛查和培养，结果为阴性，并对10例患者进行了流行病学调查。综合实验结果可能排除结核病的可能性。

图1痰标本的免疫荧光双重染色检测结果

2.2痰涂片镜检结果

痰标本80例疑似肺结核，45例阳性，免疫荧光双重染色试验，45例患者标本均为阳性；对35个阴性样本进行了免疫荧光双重染色试验，其中25个阳性，10个阴性。80例疑似肺结核患者的痰标本中，免疫荧光双重染色阳性率为87.50%，痰涂片阳性率为56.25%，免疫荧光双重染色阳性率较高，两种检测方法的π2检测配对，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2痰涂片与免疫荧光双重染色检测结果比较

2.3痰培养结果

在80例疑似肺结核患者的痰标本中培养了60株结核分枝杆菌。与免疫荧光双重染色比较，见表3。60个阳性培养标本进行免疫荧光双重染色试验，均为阳性，20个阴性标本进行免疫荧光双重染色试验，其中10个阳性，10个阴性。80例疑似肺结核患者痰标本中，免疫荧光双重染色阳性率为87.50%，痰培养阳性率为75.00%，免疫荧光双重染色阳性率较高，两种检测方法的π2检测配对，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3痰培养与免疫荧光双重染色检测结果比较

3讨论

结核分枝杆菌肺炎是一种空气传播的慢性传染病，目前由于流动人口增加和耐药结核的发展，结核分枝杆菌肺炎已成为一个更令人担忧的公共卫生问题。结核分枝杆菌肺炎与非结核分枝杆菌肺炎的临床特点相似，症状复杂，特异性强，鉴别诊断要求较高。涂膜荧光染色法是结核分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌的常规检测方法，与荧光染料有亲和力，可以荧光染色。进行荧光染色试验具有灵敏度高、无汞蒸汽污染、操作成本低、操作过程简单、荧光强等特点，但诊断灵敏度有待提高。胸腔积液生化指标检测敏感性较低，容易误诊、影响患者治疗的局限性很多。现代研究表明，结核分枝杆菌是一种单核巨噬细胞侵入人体后可吞咽的细胞内寄生虫，体内感染结核分枝杆菌，结核分枝杆菌特异性抗原可在体内发生，对结核抗原检测具有一定的临床价值。结核分枝杆菌肺炎的防治是一个系统的过程，及时有效的诊断具有很大的价值。免疫荧光双重染色分析可以在多次递增兴奋后使用荧光信号，荧光衰减时间可以提高检测的准确性和特异性。ESAT-6通过nlr家族pyr 3域蛋白(NLRp 3)诱导激活小炎症体，可引起巨噬细胞坏死和炎症。PPD可以反映身体中性粒细胞的变化，也可以通过分枝杆菌抗原引起的CD4+T细胞延迟过敏感。免疫荧光双重染色在肺炎结核分枝杆菌患者诊断中具有较高的敏感性和特异性。从机理分析来看，免疫荧光双重染色可以防止肺结核患者因免疫反应低而产生假阴性。同时，激光扫描共焦显微镜具有高分辨率、高灵敏度的特点，通过积累多次激活的荧光信号，同时检测多种物质，提高了检测效率，检测过程不受蛋白质稳定性。

结束语

总之，免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌患者中的应用诊断敏感性和特异性均超过98.0%，提高了检出率，为结核分枝杆菌肺炎的早期诊断提供了一定的依据。

参考文献

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