三疣梭子蟹性别决定基因的定位及功能鉴定

三疣梭子蟹性别决定基因的定位及功能鉴定

张伟

日照市天坤水产有限公司  山东日照 276826

摘要：三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）是我国重要的经济蟹类之一，其肉质鲜嫩、蛋白含量高、必需氨基酸齐全且风味独特，深受广大消费者喜爱。据统计，2021年我国海捕蟹总产量64.71万t，其中三疣梭子蟹45.45万t，占海捕蟹的70.24%。基于此，本篇文章对三疣梭子蟹性别决定基因的定位及功能鉴定进行研究，以供参考。

关键词：三疣梭子蟹；性别定位；基因功能鉴定

引言

三疣梭子蟹是我国海水养殖的主要品种之一，岩水转移具有性别二分法性质，由于岩水的生长速度和特性不同，市长/市场价值差异很大，因此建立性别控制技术来实现三疣梭子蟹的单极养殖，可以大大提高三疣梭子蟹的养殖效果。蟹类性别控制的研究很困难，还看不出成功报道的主要原因是缺乏有效的方法来扭转性别因素。要突破这一技术，就必须定位性别决定基因，分析性别决定机制，然后在性别分化的关键时期敲除或过度表达性别决定基因，获取用于养育全男性或全女性的信息。基因的性别定位和功能鉴定是甲壳动物性别控制技术突破的关键。本研究旨在筛选和功能研究三疣梭子蟹性别决定基因，明确三疣梭子蟹性别决定的主要基因和重要时机，分析性别决定机制，为以后的性别控制研究提供依据。

1研究背景

三疣梭子蟹、全疣梭子蟹、多疣梭子蟹、快速生长、市场价值高、经济潜力大，是我国重要的河蟹经济养殖。但是，人工水产养殖的发展继续受到类似的残馀物、低产量和早期群体刺激等因素的影响，单方面繁殖有助于减少其物种的数量，提高预期寿命，并有效地控制繁殖组织的早期成熟。性别控制是实现单极性生殖的关键，但确定性别和统一虫害科的机制尚不清楚，但普遍的假设是，通过一系列前列腺切除和移植实验，通过消除前列腺癌研究中的胰岛素抵抗，男性发育得到证实，前列腺发育、保存和抑制全壳中的女性性别，表明病毒学基因在分割雄性螃蟹方面发挥着关键作用，基于病毒学的性爱技术具有良好的应用潜力。3个疣体，即天然氨溶蛋白生化提取难以满足生产需求，对于研究氨溶蛋白的功能和分子机制至关重要，对于重组氨溶蛋白物理准备议定书至关重要。

IgA是一种促进前列腺癌激素排放的蛋白质。它被称为催化剂，因为它像哺乳动物的胰岛素一样，是协调性别差异的关键因素。IgA具有胰岛素超松弛剂的特性，它从原胰岛素蛋白、Sempron、b、c、a链从n到c、信号和c肽分裂成轮胎，a链和b链由两种化学物质连接。此外，n-葡萄糖(NCT)的潜力和链a中的两个断点。为了提高核心表达系统的性能和蛋白质的分辨率，一些分子伙伴蛋白可以与目标蛋白一起表达，以减少目标蛋白，这些分子伙伴与目标蛋白一起表达，从而促进蛋白质折叠。三个疣体寿命短，生长迅速，食肉，受到了大消费者的欢迎，近年来市场需求有所增加。2017年渔业统计年鉴显示，三鼓螃蟹总产量119777吨，总面积24864公顷。3只蟹尝起来漂亮，营养丰富，经济价值比螃蟹高得多，特别是与现有尾巴相比，房子发育良好，但不是3只蟹的体型，男女生长速度不同，在青春期前，螃蟹生长得更快，雌性螃蟹生长得更快。女性成年个体比男性螃蟹成熟，男性螃蟹比女性成熟。盐直接影响三足螃蟹的发育和生存。夏季几次剧烈雷暴，盐水养殖急剧下降，导致三疣蟹体内失衡加剧，导致生长缓慢，生产力低下。本病的发生也是影响三疣螃蟹繁殖的重要问题，其中wssv bazi illus综合征和二次血清素细菌是三疣螃蟹死亡的主要原因。低盐抗生素是三疣螃蟹繁殖的重要标志，研究深层适应性和免疫保护的分子机制至关重要。

2材料与方法

2.1试验材料与试剂

梭子蟹男女各取10只，雌蟹重50 ~ 100克，雄蟹重100 ~ 150克。获取TaqDNA酶和标准分子量(Marker)DL2000marker。

2.2 DNA提取

取活螯肢肌肉，用高盐法提取基因组Dna，取等量Dna混合物，构建雌、雄梭子蟹Dna基因池。

2.3实验引物

根据已公布的引物，选择了8个正向引物(me1~me8)和11个反向引物(em1~em8)。

2.4 RNA提取及反转录

用三唑法提取各个实验组总RNA，用核酸剂量计测定RNA浓度和质量，用1.0%琼脂糖凝胶电泳测定其完整性。按照试剂盒说明书(Takara)primescriptreagentkitwithgdnaeraser进行反转录，合成用于基因定量分析的cDNA模板。

2.5数据分析

结果以平均标准差的形式表示，使用统计分析软件(SPSS ) 20.0分析数据的统计意义。结果首先用Kolmogorov-SmirnovandCochran检验方差的均匀性，如果方差不均匀，则用非参数Mann-Whitney检验法进行分析；如果方差很整齐，则用Duncan或t检验法进行分析。p < 0.05的分析结果表明差异很大，用不同的字母表示

3结果分析

3.1梭子蟹雌、雄个体的遗传差异

结果显示，女性和男性基因DNA水平存在明显差异，但大多数地方的性别差异仅显示为个体差异(图1)。表现为特定SRAP点的单个遗传特征是可见的或隐含的，而且没有任何特定的地方可以根据基因组识别所有的女性和男性性别。但是，在5个SRAP扩展组合中，6个小鼠和小鼠位置的放大差异较大，其中男性和女性占男性总数的12.5%至20%(图2，图2)。这两个数字表明，男性和男性性别完全是女性(图1)。遗传距离介于0.1583到0.4041之间的TFPGA包计算真核之间的遗传相似系数，并使用UPGMA方法创建单个Polygram图(图4)。大多数女性更接近于继承，倾向于聚集，而男性则更远。

表1特异位点及显性基因型雌雄所占的比例

图1m8-em9在雌、雄个体间的扩增图谱

图2m3-em8在雌、雄个体间的扩增图谱

图3m8-em4在雌、雄个体间的扩增图谱

图4三疣梭子蟹雌雄个体的聚类图

结束语

本研究在前期工作的基础上，对三疣梭子蟹性别决定相关基因的筛选和功能进行了研究:通过比较转录分析，结合SD区划信息，准确筛选性别决定相关基因；通过分子生物学技术，如原位杂交和RNAi，进一步研究关键候选基因在性别决定中的作用机制。从实验结果中得出的主要结论如下:

1、完成了幼鱼发育期的性别鉴定和转录组测序:鉴定了从MMP到ⅱ期幼蟹共6个发育期的个体性别，制备了男女混合RNA池，并对转录组进行了高通量测序，共获得86.84G优质淡色库蚊。

2、鉴定了性别DEG，并固定了性别决定关键候选基因:主要通过几丁质代谢过程、Dna复制和视黄醇代谢等与生长和蜕皮有关的途径，在发育早期筛选了1915个男女基因的DEG，锚1个性别决定关键候选基因PtDMY。

3、初步验证了PtDMY基因是决定性别的关键基因:发现PtDMY基因与性别密切相关，在幼体发育中瞬时表达最高，主要位于蟹体内的精巢和性腺组织中。PtDMY基因向下敲除后，与性别相关的基因，如IAG和Dmrt，表现出显着的下降表达趋势，暗示PtDMY基因可能是决定性别的路径上游的关键基因。

参考文献

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