注射用水微生物限度检查新方法

注射用水微生物限度检查新方法

付通

山东省淄博市高新技术产业开发区

摘要：在符合药典要求下，对原有注射用水微生物限度需氧菌检验方法进行优化并对优化后的检验方法进行确认。药品微生物限度检查主要是检查药品中非规定灭菌剂及原料辅料中微生物污染的情况，它主要是检测活体微生物的数量是否在规定的范围内，方法：在样品取样量不变的情况下，改变冲洗剂量查看检测结果是否有变化。结果：验证过程顺利，利用薄膜过滤法确定纯化水、注射水以及纯蒸汽检验方法按照新方法执行对检测结果无影响。结论：新方法在污染菌的检出率较现行方法不变的前提下，在检验效率以及费用上有显著提高。

关键词：注射用水、微生物限度、薄膜过滤法、提高效率。

引言：药品：依据《中华人民共和国药典》相关法规进行检测。药品生产用水的质量直接影响到药品的质量，因此注射用水的质量控制，特别是微生物学指标的控制极其重要。企业在建立微生物污染监测方法时，需要从方法的灵敏度、污染菌检出率、样本量、培养时间、费用以及技术的复杂性等方面去综合评价，找到最适宜的方法并长期追踪。

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一、抗菌药物微生物限度检查中的完整性分析

检测应该在环境洁净度，局部洁净度达到百级的单向流的空气区域内进行。在检测的过程中要求全程进行无菌操作，避免发生污染，以免干扰检测结果。检测室要定期进行清洁，洁净检测室内设置空气净化系统，环境中的悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的数量要达到国家的洁净度标准。洁净检测室内不能进行阳性菌株的相关实验检测，其应在固定的阳性菌检测室进行实验检测。

（1）仪器与材料：

生物安全柜（BIOBASE），1XG1.C型普通卧式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；薄膜过滤器（德国赛多利斯公司）；0.45μm无菌滤膜（泰林生物）。验证用供试品 注射用水：选取三个点位的注射用水。三个点位的纯蒸汽。

验证用玻璃器具：电烘箱烘干，仪器中于121℃灭菌30分钟后方可使用，仪器：镊子、100ml滤杯，100ml量筒。验证用培养基及缓冲液：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）；胰酪大豆胨液体培养基(TSB)；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨(SCB)；R2A琼脂培养基(R2A)；含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨。

标准菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。

（2）方法与结果：

供试品：注射用水、纯蒸汽。计数方法验证：注射用水计数方法验证。实验组：将不大于100cfu的菌液和100ml供试品倒入过滤器中，过滤。用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。菌液组：将不大于100cfu的菌液及100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。

（3）供试品对照组：将100ml供试品注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。

培养与计数：采用R2A琼脂培养基于30～35℃培养5天（供试品对照组培养5天5小时），繁育结束点计菌落数并报告。纯蒸汽计数方法验证。实验组：将不大于100cfu的菌液及100ml供试品注入过滤器当中，过滤。用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。菌液组：将不大于100cfu的菌液100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。供试品对照组：将100ml供试品注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。培养与计数：采用R2A琼脂培养基于30～35℃培养5天（供试品对照组培养5天5小时），繁育结束点计菌落数并报告。

（4）纯化水计数方法验证

实验组：取50mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨注入过滤器中，然后成不大于100cfu的菌液及1ml供试品注入过滤器中，过滤。用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。菌液组：取50mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨注入过滤器中，加入不大于100cfu的菌液，过滤后，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。供试品对照组：取50mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨注入过滤器中，然后将1ml供试品注入过滤器中，过滤后，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。培养与计数：采用R2A琼脂培养基于30～35℃培养5天（供试品对照组培养5天5小时），繁育结束点计菌落数并报告。

（5）验证公式：

实验组的菌落回收率=

（6）结果判断：

完成三次独立的平行实验后，计算每一次验证实验的结果，即实验组的菌落回收率的结果，应在0.5～2.0范围内。若实验组的菌落回收率均在此范畴内，则平皿计数方法验证可行。

若任一次实验中任一实验菌株实验组菌落回收率不在0.5～2.0范畴内，先按照从操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件等方面逐一查找原因，然后按照《偏差调查处理SMP》进行分析，如为操作者、设备、物料、操作方法、环境条件等因素，应重新进行实验，如非上述因素造成菌落回收率不在0.5～2.0范围内，则标明供试品在此查验前提下有抑菌作用，那么应采用相宜的除去抑菌活性方式，并重新进行验证实验。按照消除抑菌活性的方法选用其他方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并从新举行方法实验。

二、数据汇总

验证项目见表1

表1：验证项目

数据汇总

表2：注射用水结果汇总表

表3：纯蒸汽结果汇总表

表4：纯化水结果汇总表

三、注射用水微生物限度规范

对注射用水进行定期检测，发现注射用水微生物污染到达警戒限度、纠偏限度时应当按照操作规程处理，制药企业应对注射用水微生物污染情况进行长期的跟踪监测，掌握其趋势变化，适时采取必要的措施保证注射用水质量持续符合法规要求，那么，适宜的注射用水微生物污染监测手段显示出尤为重要。

R2A琼脂培养基，30-35℃，培养5天5小时的培养体系，该方法灵敏度高，有利于大多数水系统中污染菌的检出。R2A琼脂培养基属于低营养培养基，一般来说更有利于分离成长缓慢的细菌和营养要求较低的细菌，但是一些富养菌也能够在R2A琼脂培养基上生长，5天的培养时间有利于受损微生物，缓慢生长的微生物以及生长要求苛刻的微生物的检出。改进后的方法科学合理，对培养结果并无影响的同时节省材料时间，提高工作效率。

总结：微生物限度检查工作是一项复杂的工作，其中任何一个环节的失误都可能影响到最终的实验结果，在对抗菌药物进行微生物限度检查的时候，需要做好每一个细节，根据规定来进行试验，才能够得到进行正确的判断，得到科学的结果。

参考文献：

[1]张光华，中国医药工业杂志 Chinese Joumal of Pharmaceuticals 2015,46(12)