高校液相色谱法测定吲达帕胺片的含量

高校液相色谱法测定吲达帕胺片的含量

刘会改

通讯作者 路亚红

石家庄杏林锐步医药科技股份有限公司 河 北 石家庄 050000

摘要：目前,吲达帕胺片质量标准已收载入中国药典2020年版二部中，其含量测定采用紫外分光光度法。本文主要论述采用高效液相色谱法测定吲达帕胺片的含量。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×150mm，5µm）；以0.1%磷酸水溶液-乙腈-甲醇（60:30:10）为流动相；柱温25℃；流速为每分钟1.5ml；检测波长240nm。

关键词：高效液相色谱法；吲达帕胺；含量测定；

吲达帕胺为磺胺类利尿药，临床上主要用于治疗原发性高血压。

目前，吲达帕胺片质量标准已收载入中国药典2020年版二部、国外药典（USP、BP、JP）中。ChP2020吲达帕胺片的含量测定分析方法为紫外分光光度法，USP、BP、JP中采用的为高校液相色谱法。优先考虑专属性好、灵敏度高的HPLC法。考虑USP、BP的含量测定中均采用离子对试剂作为流动相，而JP中选择0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（6:3:1）作为流动相，成分简单，且易于冲洗，我们选择在JP基础上建立吲达帕胺片的含量测定分析方法。

一、主要仪器与试剂

高效液相色谱仪、分析天平、超声波清洗仪。水、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、磷酸、无水乙醇、吲达帕胺对照品。

二、分析方法建立

1.流动相及色谱柱的确认

参考JP中吲达帕胺片质量标准，我们选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，经筛选，以Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×150mm，5µm）作为色谱柱；并采用JP中的流动相0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（6:3:1）。

2. 检测波长的选择

根据吲达帕胺对照品的全波长扫描图谱，吲达帕胺在208nm、240nm附近均有吸收，但208nm波长较低，考虑到空白辅料可能带来的干扰以及紫外灯寿命问题，选定本方法的检测波长为240nm。

3. 流速的选择

参照JP吲达帕胺片质量标准，在柱温30℃条件下，分别设置流速为每分钟1.5 ml、1.8ml，采集色谱图，其主峰保留时间依次为5.9min、4.9min，均可，我们选择1.5ml/min作为本方法的流速。

4. 柱温的选择

筛选不同柱温：25℃、30℃、35℃、40℃。结果发现各温度条件下理论板数与对称因子未有显著变化，但柱温高于30℃时，主峰前未知杂质与主峰无法达到分离，因此选定本方法的柱温为分离效果更好的25℃。

5. 进样浓度的选择

分别配制浓度为10μg/ml、25μg/ml供试品溶液进行含量测定，两个浓度的样品含量依次101.2%、99.7%，基本一致；对称因子与理论板数无显著差别，但浓度为10μg/ml时信噪比仅为737.6，远低于2000，因此本方法样品浓度选用25μg/ml。

6. 进样体积的选择

考察进样体积为10μl、20μl及50μl。进样体积50μl时，理论板数显著降低；进样体积10μl和20μl时的信噪比均大于2000，符合要求，但进样体积10μl时理论板数较高，因此本方法选择进样体积为10μl。

7. 最终确定的分析方法

色谱条件  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×150mm，5µm，或效能相当的色谱柱）；以0.1%磷酸水溶液-乙腈-甲醇（60:30:10）为流动相；柱温25℃；流速为每分钟1.5ml；检测波长240nm。

供试品配制  取本品20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（相当于吲达帕胺2.5mg），置100ml量瓶中，加溶剂适量，振摇超声至少30min使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，经0.45μm有机针式过滤器滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液：取吲达帕胺对照品适量，精密称定，加50%乙醇溶解并稀释制成每l ml中约含25µg的溶液。

三、分析方法验证

1.系统适用性

取对照品溶液，连续进样6针，吲达帕胺峰面积的相对标准差为0.1%，小于2%。系统适用性良好。

2.专属性

经酸、碱、氧化、高温、高湿、光照破坏后，空白溶液、空白辅料在吲达帕胺主峰位置均无干扰；降解产物峰与主峰之间的分离度介于1.07～25.15，符合要求；以二极管阵列检测器检测主峰纯度，角度均小于阈值，符合要求。专属性良好。

3.线性与范围

配制不同浓度（40%、50%、60%、75%、125%、100%、150%）的对照品溶液，测定，得出回归方程为y=0.3804x-0.0144，R2为0.9998，线性良好。

图1 吲达帕胺线性关系图

4.准确度

配制80%、100%、120%浓度的加标溶液，每个浓度平行配制3份，进行测定。平均回收率为100.1%，RSD（n=9）为0.6%，准确度较高。

5.精密度

由不同操作者分别在不同日期使用不同仪器，配制6份供试品溶液，并测定。RSD=0.9%、0.6%（n=6），RSD=0.8%（n=12）。精密度良好。

6.耐用性

该方法在流动相中磷酸水溶液比例（±5%）、乙腈比例（±5%）、甲醇比例（±3%）、配制磷酸水溶液磷酸加入量（±0.2ml）、柱温（±5℃）、波长（±5nm）、流速（±20%）及同一厂家同一型号不同批号色谱柱各条件变化之后，吲达帕胺片的含量测定RSD 为 0.8%，测定结果均在 94%～96%之间，符合规定，耐用性良好。

四、总结

综上所述，根据《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》及相关指导原则，对建立的吲达帕胺片含量测定方法，从专属性、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等方面进行方法学验证，结果表明：本方法专属性好、精密度好、准确度高、线性良好、耐用性好，适用于吲达帕胺片含量测定。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版 二部.中国医药科技出版社，2020.05:589.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版 四部.中国医药科技出版社，2020.05:480-483.

[3]课题研究组.化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则. 2005.03:1-13.

[4]JP18:1049-1050.

[5]USP40:115-116.

[6]BP2018.