HPLC-DAD法同时测定抗病毒口服液中四种防腐剂含量

HPLC-DAD法同时测定抗病毒口服液中四种防腐剂含量

王瑀,荆汉卫,史瑶瑶

（潍坊市检验检测中心，山东潍坊261000）

【摘要】目的：建立HPLC-DAD法检测抗病毒口服液中可能添加的山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯4种防腐剂的使用情况。方法：采用高效液相色谱/二极管阵列检测器（HPLC/DAD）法，同时测定抗病毒口服液中4种防腐剂含量。结果：所建 HPLC/DAD法专属性好，以峰面积（y）对进样量（x）进行线性回归，建立的标准曲线方程R2在0.9998-1.000之间，平均加样回收率结果在99.5%-102.8%之间，所测50批样品中，有一批样品的检测结果与说明书不符，表明其可能存在非法添加防腐剂情况。结论：本方法精密度、回收率高，可作为抗病毒口服液中非法添加防腐剂的监督检测方法。

关键词：抗病毒口服液；防腐剂；高效液相色谱法

【Abstract】Objective: To establish high performance liquid chromatography (HPLC) to detect the use of sorbic acid, benzoic acid, methylparaben and ethylparaben in antiviral oral liquid.Methods: Using high performance liquid chromatography/diode array detector (HPLC/DAD) method, the contents of 4 kinds of preservatives in antiviral oral liquid were determined at the same time.Results: The specificity of the established HPLC/DAD method was good. The peak area (y) was used to linearly regress the injection volume (x), the established standard curve equation R2 was between 0.9998 and 1.000, and the recovery rate was between 99.5%. and 102.8%.Among the 50 batches of samples tested, the test results of one batch of samples were inconsistent with the instructions, indicating that they may have illegally added preservatives.Conclusion: The method has high precision and recovery rate, and can be used as a supervision and detection method for illegally adding preservatives in antiviral oral liquid.Among the 50 batches of samples tested, the test results of one batch of samples were inconsistent with the instructions, indicating that they may have illegally added preservatives.

在检测的50批次样品中，有1批次样品的检测结果与说明书不符，表明其可能非法添加防腐剂。

Among the 50 batches of samples tested, the test results of one batch of samples did not conform to the instructions, indicating that there may be illegal addition of preservatives.

在检测的50批次样品中，有1批次样品检测结果不符合说明书，表明可能存在非法添加防腐剂的情况。

Key words: Antiviral oral liquid; Preservative; HPLC

抗病毒口服液是以“白虎汤”和“清瘟败毒饮”为基础改良的非处方药［1］，其有效成分包括板蓝根、石膏、芦根、生地黄、郁金、知母、石菖蒲、广藿香、连翘等九味中药。其具有清热祛湿、凉血解毒之功效，常用于风热感冒、温病发热等病症［2-3］。中药合剂中一般含有油脂类、糖类等，久置易腐败，加入适量防腐剂可延长药品的保质期、防止霉变

［4］。2020版《中国药典》四部“合剂”项下规定，山梨酸和苯甲酸的用量不得超过0.3% （其钾盐、钠盐的用量分别按酸计），羟苯酯类的用量不得超过0.05%［5］。防腐剂过量服用，对人体器官代谢会造成危害，故防腐剂在使用过程中应该严格控制用量［6-7］。2020版《中国药典》一部中对于抗病毒口服液的质量控制主要是通过薄层色谱鉴别其主要成分，HPLC法测定连翘中连翘苷的含量，对防腐剂的测定没有相应标准［8-9］。本文采用HPLC/DAD法测定抗病毒口服液中山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯4种防腐剂的使用情况，以期为抗病毒口服液的质量控制提供参考。

1.仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪（Agilent1260，美国）；C18色谱柱（Agilent，美国）；；MS105DU型电子天平（Mettler-Toledo，瑞士）；超声波清洗器（杭州超声波有限公司）

1.2试剂与试药

山梨酸（批号190126-202102纯度99.7%）、苯甲酸（批号100419-201703 纯度99.9%）、对羟基苯甲酸甲酯（批号100278-201906纯度99.9%）上述三个对照品均购自中国食品药品检定研究院；对羟基苯甲酸乙酯（批号lcs0720CA13纯度100%），购自科顺生物；样品共计50批，编号为1-50，来源于山东省市场监督管理局抽样。

乙腈（色谱纯，默克公司）、89磷酸（色谱纯科密欧公司）、乙醇（优级纯国药集团），水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl（4.6mm×250mm 5µm）；流速：1.0mL/min；检测波长：苯甲酸为230nm；山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯为256nm；柱温：25℃；流动相A：乙腈；流动相B：0.2%磷酸水溶液；以A：B为按下表1中规定进行梯度洗脱。

表1梯度洗脱程序

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液的制备精密称取山梨酸10.89mg、苯甲酸11.78mg、对羟基苯甲酸甲酯11.31mg、对羟基苯甲酸乙酯11.45mg，至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.2.2供试品溶液的制备精密量取本品溶液1ml，至25ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。精密吸取上述稀释液5ml，至25ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备按抗病毒口服液处方比例和制备工艺，自制不含防腐剂的抗病毒口服液。按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.4方法学考察

2.4.1专属性

分别取2.2项下三种溶液各10μl，按照2.1色谱条件进行分析，并记录谱图。结果供试品溶液在与四种防腐剂对照品的相同保留时间处有吸收峰，而阴性样品中未出现与对照品保留时间相对应的峰，表明该方法可行。见图1。

 A对照品（256nm）       B对照品（230nm）     C供试品（256nm）  D供试品（256nm）

F阴性样品（256nm） G阴性样品（230nm） E供试品（230 nm）

1.山梨酸2.苯甲酸3.羟基苯甲酸甲酯4.羟基苯甲酸乙酯

图1各防腐剂HPLC色谱图

2.4.2线性关系分别精密2.2.1项下对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、20μl，按“2.1”项色谱条件下进行测定，以峰面积值为纵坐标（y），进样量（μg）为横坐标（x）绘制标准曲线，并进行回归，结果见表2。各成分在相应范围内均呈良好的线性关系。

表2 四种成分回归方程及线性范围

2.4.3精密度试验在“2.1”项色谱条件下，精密吸取2.2.1项下对照品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积积分值。结果山梨酸的RSD为0.31%，苯甲酸的RSD为0.67%，对羟基苯甲酸甲酯的RSD为1.1%，对羟基苯甲酸乙酯的RSD为0.44%，表明仪器精密度符合相关要求。

2.4.4重复性试验 取含不同防腐剂的样品，按“2.2.”项下的制备方法各制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，计算各成分的含量。结果山梨酸含量的RSD为1.08 %，苯甲酸含量的RSD为0.66%，对羟基苯甲酸甲酯含量的RSD为0.39%，对羟基苯甲酸乙酯含量的RSD为0.51%，表明该方法的重复性符合相关的技术要求。

2.4.5稳定性试验 取含不同防腐剂的样品，按“2.2.3”项下的制备方法各制备，在“2.1”项色谱条件下于0、1、4、8、12、24h进样，测定峰面积，结果山梨酸峰面积的RSD为1.08 %，苯甲酸峰面积的RSD为0.66%，对羟基苯甲酸甲酯峰面积的RSD为0.39%，对羟基苯甲酸乙酯峰面积的RSD为0.51%，，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.4加样回收率试验取已知各防腐剂含量的供试品，精密吸取0.5ml，加入相应量的对照品，“2.2.2”项下的制备方法，各制备6份。在“2.1”项色谱条件下，进样6次，计算加标回收率，结果见表3，表明该方法准确度符合相关要求。

表3加标回收率试验结果（n=6）

2.5结果对12家企业的50批次样品分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表5（表中“-”为未检出）。其中检查山梨酸的样品为11批次，山梨酸含量为0.23%-0.25%；检查含对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯（同时含有）为11批次，总量为0.018%-0.022%。检查苯甲酸的样品为17批次，含量为0.04%-0.24%。未检出4种防腐剂添加的为10批。本次检验中发现50号产品，其说明书中未注明防腐剂，但检测中检出其含有苯甲酸，含量为0.08%。

表4 50批次抗病毒口服液含量测定结果

注：“－”表示未检出

3 讨论

3.1测定波长的选择

采用DAD检测器，对该4种成分进行190-400nm的波长选择，发现苯甲酸的最大吸收波长为230nm，山梨酸的最大吸收波长为262nm，而对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的最大吸收波长为256nm。故采取230nm测定苯甲酸，256nm测定山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。

3.2 结果分析

结果显示，不同厂家防腐剂用量有明显差别，其中一家厂家在说明书未注明添加防腐剂的情况下，检测出其样品中含有苯甲酸，存在非法添加防腐剂的情况。所以本文建立的防腐剂的测定方法，可为控制防腐剂的使用提供了方法依据。

参考文献

[1]罗晶,施法,陈晓辉,侯峰..HPLC法同时测定抗病毒口服液中4种防腐剂[J].西北药学杂志,2012,27(01):36-38.

[2]王捧英,李国川,李朝悦..HPLC同时测定抗病毒口服液中的(R,S)-告依春和连翘苷[J].华西药学杂志,2019,34(02):173-175.

[3]邱陈劲,孟鹤,谢小燕. 高效液相法同时测定抗病毒口服液中三种成分的含量测定及其指纹图谱[C].中国药学会第四届药物检测质量管理学术研讨会资料汇编,2017:256-260.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020年版四部[S].北京：中国医药科技出版社，2020：26.

[5]张筱,隋海山,李现菊.HPLC-DAD法同时测定复方甘草片中3种有效成分和5种防腐剂[J].中成药,2022,44(02):376-380.

[6]周凌,赵月然,康凯.HPLC法对清喉咽合剂中防腐剂非法添加的测定[J].中国药物评价,2020,37(05):370-373.

[7]周凌,姜范成,李宪刚..HPLC法同时测定通脉口服液中9种甜味剂和防腐剂的研究[J].中国药物评价,2019,36(01):37-40.

[8]宋瑛,王红芳,张溪杨.不同包装对抗病毒口服液中连翘苷稳定性的影响[J].中成药,2021,43(09):2478-2480.

[9]李庆德,蓝献泉,彭晶.抗病毒清热口服液高效液相指纹图谱研究及含量测定[J].中国药师,2021,24(05):941-945.

1.作者信息：姓名:王瑀，性别：女，出生年月：1994年5月7日，

民族：汉，籍贯：辽宁省，学历：研究生，职称：主管药师，研究方向：中药质量评价