实验室常用的快速诊断技术在肺结核诊断中的应用价值

实验室常用的快速诊断技术在肺结核诊断中的应用价值

王慧,陈永红,徐成春

（安徽省宣城市人民医院检验科 皖南医学院附属宣城医院 安徽宣城 242000）

摘要：目的 评估实验室常用的三种快速诊断技术在诊断肺结核的临床应用价值。方法 收集肺结核患者痰或支气管、肺泡灌洗液标本55例，同时进行Xpert MTB/RIF法、荧光PCR法、直接涂片法检测结核分枝杆菌（Mtb）。以Xpert MTB/RIF检测为金标准，分析荧光PCR法、直接涂片法的诊断效能，比较三种方法检测结核分枝杆菌的阳性检出率。结果 荧光PCR法和直接涂片法分别检测结核分枝杆菌的灵敏度分别为75.00%、42.50%,特异度分别为73.33%、86.67% 。Xpert MTB/ RIF检测结核分枝杆菌阳性检出率为72.73%，,荧光PCR法为61.82%，涂片法为34.55%。

关键词：Xpert MTB/RIF；荧光PCR；肺结核

1.资料与方法

1.1标本来源 依据《临床诊疗指南.结核病分册》诊断为肺结核病，收集2021年1月至2022年1月的肺结核病患者的痰或支气管、肺泡灌洗液标本57例。其中有2例鉴定为非结核分枝杆菌的标本，没有纳入统计例数，实际有效实验对象为55例。

1.2仪器与试剂 仪器：使用 GeneXpert MTB/RIF检测系统、Agilent Mx3000P实时荧光PCR检测系统、生物安全柜、涡旋震荡器、迪尔结核菌自动染色仪器、奥林帕斯显微镜等。

1.3检测方法

抗酸染色涂片法:按结核病实验室标准化操作流程，由贝索生物科技有限公司提供染液，釆用萋-尼氏染色法后进行人工镜检。

（1）荧光PCR法：（1）提取标本的DNA 取0.5毫升标本，加入1倍样本体积4%的NaOH，液化15分钟后15000转/分钟离心5分钟，去上清液；（2）向沉淀物中加入0.5毫升灭菌水，振荡混匀后，15000转/分钟离心1分钟，去上清液，重复洗涤3次；（3）沉淀中加入50微升DNA提取液，振荡混匀后，100℃金属浴10min后取出冷却至常温后15000转/分钟离心6-7分钟，取上清液进行PCR扩增报告结果。

（2）Xpert MTB/RIF法:按仪器使用操作说明书操作（1）前处理 视样本性状加入1-2倍体积0.067M PBS液化标本。（2）在生物安全柜内，涡旋震荡处理，10-15分钟，再静置5分钟，取2毫升处理样品，由检测匣的加样孔缓慢加入。（3）将反应盒放入仪器中检测，自动化检测出结果。

1.4.结果判定:（1）涂片法结果 根据结核杆菌含量人工镜检判为：4+、3+、2+、1+、1-8条/300视野、阴性6个报告标准。（2）荧光PCR结果 PCR扩增曲线规则且呈对数增长，ct值<36，即为阳性；若扩增曲线不规则或ct值>40，即为阴性；若ct值在36至40之间且扩增曲线呈对数增长，标本需重复检测，此时ct值仍在35～40之间，即可报告为阴性。（3）GeneXpert MTB/RIF检测结果是依照探针的循环阈值判定 ct值<16可判定为高丰度、ct值在6-22可判定为中丰度、ct值在22-28可判定为低丰度、ct值>28可判定为极低丰度、未检测到结核分枝杆菌目标DNA可判定为阴性5种报告模式。

2.结 果

2.1对比三种方法的检测效能评价

采用Xpert MTB/RIF检测为金标准,用三种方法进行检测结核分枝杆菌。与Xpert MTB/RIF法相比荧光PCR法检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 75.00% (30/40)、73.33% (11/15)、88.24% (30/34)、52.38% (11/21),直接涂片法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为42.50% (17/40)、 86.67%(13/15)、89.47%(17/19)、36.11%(13/36),三种方法检测结核分枝杆菌的敏感度特异度相比较，显示荧光PCR法检测敏感度高于直接涂片法,特异度低于直接涂片法。

2.2对比三种方法的检测结核分枝杆菌的一致性检验评价

三种方法检测结核分枝杆菌。Xpert MTB/RIF法与荧光PCR法的一致性检验显示kappa检验 K=0.43，说明两者一致性较好；Xpert MTB/RIF与传统的直接涂片法比较，一致性检验显示kappa检验值K=0.20，表明两者一致性较差。

2.3不同检测方法结核分枝杆菌阳性检出率比较

釆用Xpert MTB/RIF法、荧光PCR法、直接涂片法检测结核分枝杆菌,阳性检岀率分别为72.73% (40/55)、61.82% (34/55)、34.55% (19/55)。 根据检测的阳性率显示：Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的阳性率最高为72.73%；其次为荧光PCR阳性率居中为61.82%；涂片法阳性率仅为34.55%，可见直接涂片法阳性率较低。三种方法的阳性检出率做卡方统计显示，Xpert MTB/RIF阳性率高于涂片法，两者比较差异有统计学意义(

χ=16.12，P＜0.05)；Xpert MTB/RIF阳性率也高于荧光PCR法，两者比较差异无统计学意义( χ=1.49，P＞0.05)；涂片法阳性率低于荧光定量PCR法，两者比较差异有统计学意义( χ=8.19,P＜0.05)。

3.讨 论

Xpert MTB/RIF法、荧光PCR法和直接涂片法对比检测结核分枝杆菌效能提示：荧光PCR法敏感度(75.00%)和一致性(0.43)高于涂片法，但是特异度(73.33% )低于涂片法(86.67%),与其他报道略有不同[6]。对此分析结核分枝杆菌的检出检测依赖于样本中细菌载量，可靠的结果依赖于正确的样本采集、处理和存储程序。未遵循要求的样本采集程序、处理或储存、技术错误或者起始样品浓度不够，都能引起结果有一定差异[7]。

不同检测方法结核分枝杆菌阳性检出率比较：Xpert MTB/RIF (72.73%)>荧光PCR法(61.82%)>涂片法(34.55%)。结核分枝杆菌阳性检出率和患者采集的标本量、标本的含菌量有很大关系。目前，Xpert MTB/RIF法也很难将核分枝杆菌的阳性检出率增加到百分之百。据文献显示[8]，直接涂片法一般需5*lO3 CFU(菌落形成单位)/mL以上才能检出阳性，需要标本中的含菌量较多才能检出。而Xpert MTB/RIF仅需131CFU/mL即可，95%置信区间为106.2-176.4 CFU/mL,该方法极大提高了结核分枝杆菌阳性检出率，弥补了传统涂片法因标本量少或标本含菌量少而大量漏检的不足。

另外说明，2例鉴定为非结核分枝杆菌（鸟-胞内分枝杆菌）的排除标本，经Xpert MTB/RIF检测结果均为阴性，表明Xpert MTB/RIF检测非结核分枝杆菌特异性可能也较高，由于本实验室开展Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌时间仅一年多时间，标本量积累不够，今后可以继续开展此方面研究工作。

参考文献

[1] 肺结核诊断 WS 288—2017[J].中国感染控制杂志,2018,17(7):642-652.

[2] 中华医学会.临床诊疗指南:结核病分册[M].北京:人民卫生出版社,2005:122.

[3]张学文,李国栋,陈晨楠,等.三种检测技术在涂阴肺结核快速诊断中的应用[J].中华医院感染学杂志,2022,32(5):650-653.