HPLC法测定荔枝草中咖啡酸的含量

HPLC法测定荔枝草中咖啡酸的含量

刘婷,邹琼

宜宾市第二人民医院 四川大学华西医院宜宾医院 四川 宜宾 644000

摘要： 目的 建立测定荔枝草中咖啡酸的反相高效液相色谱分析方法。方法 采用Waters Symmetry®C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），流动相为甲醇–0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长为323 nm，流速为1.0 mL·min-1。结果咖啡酸在0.9702~7.7616 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，r为0.9999，平均回收率分别为103.57%，RSD为6.17%。结论 该法简单方便、重复性好、准确可靠，可为荔枝草的质量标准提高提供依据。

关键词：HPLC；荔枝草；咖啡酸；含量测定

Determination of Caffeic acid in Salviaplebeia R.Br. by HPLC

LIU Ting  Zou Qiong

(The Second People’s Hospital of YiBin  The West China Hospital of Sichuan University of Yi Bin District

Sichuan Yibin 644000, P. R.China)

Abstract: Objective To develop a RP-HPLC method for the determination of caffeic acid in Salviaplebeia R.Br..Methods A separation was performed on a Waters Symmetry®C18 column （250 mm×4.6 mm,5 μm） with methanol-0.1%phosphonic acid as mobile phase at a gradient mode program. The detective UV wavelength was 323 nm. the flow rate was 1.0 ml·min-1. Results The results were obtained that the quantitative line range of caffeic acid is 0.9702~7.7616 μg·mL-1（r=0.9999）. The average recoveries was103.57% and the RSD was 6.17%. Conclusion This method is simple, accurate with good repeatability. This work could provide basis for  improving the quality standard of Salviaplebeia R.Br..

Key words: HPLC; Salviaplebeia R.Br.; caffeic acid; quantitative determination

荔枝草为唇形科鼠尾草属植物荔枝草（Salvia plebeian R.Br.）的干燥地上部分，为《四川省中药材标准》（2010年版）收载品种。夏、秋二季开花时采收，晒干或鲜用[1]。其味苦、辛、性凉，归肺、胃、肾经，具有清热解毒，利尿消肿，凉血止血等功效[2] [3]。近年来，随着人们对荔枝草的化学成分及药理活性的了解逐渐深入，发现其具有很高的药用价值。它含有黄酮类化合物、萜类化合物、苯丙素类化合物、挥发油类化合物及无机元素等化学成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、止咳平喘等药理作用[2] [3]。温建辉[4]等人还从荔枝草的水提液中首次成功分离了苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、胸腺嘧啶及香草醛6种成分。目前，《四川省中药材标准》（2010年版）上规定的荔枝草的检验项目很少且单一，仅包括了性状、鉴别、检查及浸出物，缺乏对有效成分的含量测定方法，质量标准有待提高。宋芹[5]等人建立了反相高效液相色谱法，等度洗脱测定荔枝草中鼠尾草酚含量的方法；陈婷、徐加兵[6]建立了梯度洗脱，同时测定荔枝草提取物中迷迭香酸、高车前苷、高车前素及芹菜素含量的反相液相色谱法，但关于荔枝草中咖啡酸含量测定的方法还未见报道。本试验采用了超声提取，反相高效液相色谱法测定荔枝草中咖啡酸含量的分析方法。该法准确可靠、专属性强、重复性好，可为荔枝草质量标准的提高提供依据。

1  仪器与试药

SPD-M20A型高效液相色谱仪（日本 岛津公司）；PB203-N电子天平（瑞士 梅特勒公司）；KQ-700DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。咖啡酸对照品（批号：110885-201703）（中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适应性试验色谱柱为Waters Symmetry®C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%磷酸溶液。线性梯度程序为：开始75%B；0～15min，75%B；15～20min，75%B～25%B；20～30min，25%B；30～35min，25%B～75%B；35～40min，75%B。流速为1.0 mL·min-1；检测波长为323 nm； 柱温为35℃；进样量10 μL。在此色谱条件下，咖啡酸与相邻峰的分离度良好，溶剂对测定无干扰。色谱图见图1。

A

B

C

图1  HPLC色谱图

A-对照品溶液；B-供试品溶液；C-50%甲醇溶液

2.2 对照品溶液的制备 精密称取咖啡酸对照品适量，用甲醇配制成646.8 μg·mL-1的对照品贮备液。精密量取5 mL对照品贮备液，置100 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液（咖啡酸32.34 μg·mL-1）。

2.3供试品溶液的制备精密称取2 g荔枝草粉末，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL50%甲醇，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4线性关系考察精密量取对照品溶液0.30、0.60、1.20、1.80、2.40 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，在“2.1”项的色谱条件下进样，记录峰面积。以组分峰面积对其质量浓度进行线性回归，其回归方程为：Y =6.121×104X-4.958×103（r＝0.9999）。结果表明，咖啡酸在0.9702~7.7616 μg·mL-1浓度范围，组分峰面积的线性关系良好。

2.5精密度试验 精密吸取质量浓度为3.8808 μg·mL-1的对照品溶液10 μL，按色谱条件重复进样6次，测得咖啡酸峰面积的RSD为0.12%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验分别吸取质量浓度为3.8808 μg·mL-1的对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定一次，共测定7次，对照品溶液与供试品溶液中咖啡酸峰面积的RSD分别为1.52%、2.78%。结果表明对照品溶液和供试品溶液均在24 h内稳定。

2.7重复性试验按“2.3”项的方法制备供试品溶液6份，分别进样，记录色谱图，按外标法计算含量。咖啡酸含量的RSD为2.64%，表明本法重复性良好。

2.8加样回收率试验取已知咖啡酸含量为0.1466 mg·g-1的荔枝草粉末1 g共9份，分别准确加入咖啡酸对照品贮备液（1.744 mg·mL-1）0.07 mL、0.09 mL、0.12 mL各3份，按“2.3”项的方法配制成低、中、高不同浓度的溶液。在“2.1”项的色谱条件下进样20 μL，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。

表1 咖啡酸加样回收率试验结果(n=9)

2.9样品的测定取荔枝草粉末，照“2.3”项的方法制备供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件测定。以外标法计算样品中咖啡酸的含量，结果3批荔枝草药材中咖啡酸的含量分别为0.1255，0.1466，0.1285 mg·g-1。

3讨论

实验分别采用了乙腈-0.1%磷酸水溶液[7]、甲醇-0.1%磷酸水溶液[8]系统作为流动相，结果甲醇-0.1%磷酸水溶液系统下，咖啡酸色谱峰的峰形较好，且与杂质峰完全分离，因此选用了甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相。由于荔枝草药材的供试品前处理方法直接用50%甲醇水溶液提取，因此提取液成分较复杂。若采用流动相等度洗脱，则杂质峰经常会对待测组分造成干扰，为了避免杂质峰的干扰，试验采用了梯度洗脱。试验对供试品溶液的提取方法、提取溶剂、提取时间分别进行了考察，最终选择了50%甲醇超声提取30分钟。在此条件下，方法的加样回收率、精密度、专属性均较好，可用于荔枝草中咖啡酸的含量测定。

参考文献:

[1]四川省食品药品监督管理局. 四川省中药材标准[S].四川出版集团·四川科学技术出版社，2010：473.

[2]王继峰，颜娓娓，徐佳馨，等. 荔枝草的化学成分及药理作用研究新进展[J].湖南中医药大学学报，20

18，38（4）：482－485.

[3]郭秋言，徐一，雷志钧. 荔枝草药理作用及临床研究进展[J].中国中医药信息杂志，2018，25（3）：136－140.

[4]温建辉，倪付勇，李明，等. 荔枝草化学成分的研究[J].中成药，2019，41（10）：2393－2397.

[5]宋芹，梁立，刘嵬，等. 基于高效液相色谱法的荔枝草中鼠尾草酚含量测定[J].成都大学学报（自然科学版），2017，36（1）：15－17.

[6] 陈婷，徐加兵. 高效液相色谱法同时测定荔枝草提取物中迷迭香酸、高车前苷、高车前素及芹菜素含量[J].中国药业，2018，27（16）：23－25.

[7]郭伟，滕亮，万琪臻，等. HPLC双波长法同时测定意大利牛舌草中3种成分的含量[J].西北药学杂志，2018，33（1）：28－32.

[8]张俊伟，张斌，唐枞贵，等. HPLC法测定蒲公英颗粒中咖啡酸、阿魏酸的含量[J].吉林医药学院学报，2018，39（1）：20－21.