Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化

Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化

刘原成

辽宁成大生物股份有限公司 辽宁沈阳 110000

摘要：Nanog蛋白能够维持胚胎干细胞的自我更新与多能性，是关键的转录因子。目前Nanog蛋白的体外生产形式主要通过微生物进行异源表达，为了能够高效制备可溶性的人源Nanog蛋白，降低Nanog蛋白的应用成本，本研究通过分子克隆技术构建重组大肠杆菌，通过IPTG诱导来进行可溶性的融合表达。

关键词：Nanog;原核表达;蛋白质纯化;发酵优化

Nanog蛋白于2003年被发现，一直以来主要通过动物细胞分离提取获得，这种获取方式的缺点在于过程过于繁琐且产率较低。现阶段已经成功通过大肠杆菌实现了小鼠来源的Nanog蛋白表达，但其产物是包涵体。通过大肠杆菌实现的人源Nanog假基因的蛋白原核表达，产物也是包涵体。虽然目前市面上已经有人源Nanog蛋白销售，但并没有人源Nanog蛋白表达的相关研究报道，而且人源Nanog蛋白的售价十分昂贵，为了降低其应用成本和促进医学实验研究，便于后期大量制备Nanog多克隆抗体，本次研究通过pET32a-Nanog构建重组质粒转入到大肠杆菌中，实现人源Nanog蛋白和硫氧还蛋白的可溶性容和表达，最终通过肠激酶酶切后得到人源Nanog蛋白，通过摇瓶来对诱导温度、诱导剂含量以及补料碳源进行优化，在15L的发酵罐上进行补料发酵的分批考察，对不同的温度控制和溶氧水平对菌体产蛋白的影响进行观察，为后期大规模制备人源Nanog蛋白和多克隆抗体打下良好基础。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌、载体和均为本实验室保存。

1.1.2 试剂与培养基

（1）种子培养基：胰蛋白胨、酵母提取物均在温度下进行的灭菌处理。

（2）斜面保藏培养基：胰蛋白胨酵母提取物、琼脂均在温度下进行的灭菌处理。

（3）发酵培养基：葡萄糖蛋白胨酵母粉 5g/L，均在温度下进行的灭菌处理。

（4）补料培养基：的甘油溶液。

（5）试剂：加拿大产聚合酶、限制性内切酶；国产酵母膏、胰蛋白胨、质粒小量提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒；国产氨苄霉素、免抗Nanog多克隆抗体及羊抗兔的二抗、核糖核酸酶。

1.1.3 仪器与设备

美国产小型胶电泳槽、蛋白干转仪、荧光检测溶液试剂盒；国产SCG蛋白纯化系统；美国产PCR仪；日本产冷冻离心机；国产光度计；国产高压蒸汽灭菌锅；国产HYL-C型组合式摇床国产发酵罐。

1.2实验方法

1.2.1 构建重组大肠杆菌表达质粒

通过查询NCBI数据库能够得到人源Nanog基因序列，基于大肠杆菌的偏好性对密码子进行优化，由国内的生工生物工程公司进行合成。以合成的Nanog基因作为模板来对引物[P1（5-CG-GAATTCATGAGTGTGGATCCAGCTTG-3）、 P2（5-CCC-TCGAGCACGTCTTCAGGTTGCATGT-3）,]进行设计，进行PCR的扩增，在95℃状态下进行10min的预变性，在95℃状态下进行30s的变性，在60℃状态下进行30s的退火，在72℃状态下进行70s的延伸，循环30次后于16℃的状态下进行10min的保温。PCR后的片段Nanog通过T/A克隆连人pMD19T-Simple处理，通过测序验证，得出正确的结果。采用限制性核酸内切酶和限制性内切酶对pMD19T-Nanog进行双酶切后胶回收目的片段，通过连接酶将片段与相同的双酶切pET32a载体进行连接，得到重组的pET32a-Nanog质粒。将适量的pET32a-Nanog质粒加入到准备好的大肠杆菌DE3感受态当中，通过热击处理进行轻轻混匀，在37℃且200r/min状态下进行2.5h的摇床培养。对菌体进行离心收集，去掉上清液后留重悬菌体均匀涂在布满氨苄霉素的LB培养基平板上，在37℃状态下进行10h的培养，挑取转化子进行菌落的PCR验证，验证正确的转化子通过摇瓶进行进一步的培养、保存、质粒提取后送到生工进行测序，得到大肠杆菌BL21( DE3 )/ pET32a-Nanog重组菌株。

1.2.2 Nanog蛋白表达量的测定

采用考马斯亮蓝染色法对其总蛋白浓度进行测定，具体采用SDS-PAGE对统一的10g总蛋白样品量进行分析，通过Image Lab软件扫描SDS-PAGE电泳图中的蛋白条带灰度，对每条泳道的Nanog蛋白占比进行分析，结合总蛋白的含量来对Nanog蛋白的含量进行计算，计算结果仅应用在不同发酵条件下的具体对比和优化方面。最终通过Bradford法对纯化之后的目的蛋白进行检测，得出准确性较高的Nanog蛋白得率。

2、结果与分析

2.1Nanog蛋白表达质粒的构建及验证

按照前文的方法对重组pET32a-Nanog质粒进行构建（图1所示），通过菌落PCR对其进行验证能够得出，PCR产物在935bp存在着较为明显的条带，这一点符合Nanog基因的大小，测序结果能够与美国国家生物技术信息中心给出的基因报告达成一致，这就证明实验获得了正确的Nanog基因序列。重组pET32a-Nanog质粒通过双酶切的鉴定能够得到5900bp及935bp的条带，代表着pET32a质粒载体及Nanog的基因序列。

a-1,2-重组表达质粒pET32a-Nanog菌落PCR产物;

M-DNA Marker; b-1 ,2-重组表达质粒pET32a-Nanog

经双酶切;M-DNA Marker

图1琼脂糖凝胶电泳检测人源Nanog重组载体pET32a-Nanog和酶切重组表达质粒pET32a-Nanog

2.2 Nanog的蛋白质印迹法检测结果

将电泳后的蛋白通过电转到硝酸纤维素膜上，进行蛋白质印迹法的免疫杂交检测。得出的结果为通过纯化酶切后得到的Nanog蛋白与市面上销售的Nanog多克隆抗体能够呈现阳性的反应，没有经过IPTG诱导的重组菌裂解液并没有特异性的蛋白条带，证明制备出的Nanog蛋白和Nanog多克隆抗体均具备较为良好的结合特异性。

结束语：大肠杆菌的表达系统成本较低，条件更加适合自动化控制，可以进行大规模的发酵。近几年通过大肠杆菌来对重组蛋白进行表达已经成为高效经济的主流形式。目前为止蛋白质的结构数据库中有超过60%的蛋白质可以通过大肠杆菌的表达系统进行生成，这为后期的Nanog多克隆抗体的大量制备打下了良好的基础。

参考文献：

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[3] 莫国臻，黄关璇，石宇昕，吴秀芹，曹传辉.下瘀血汤对肝癌细胞生物活性及Nanog信号通路表达的影响[J].世界中医药, 2022, 17(19):2733-2737.

刘原成（1993.8），男，汉族 辽宁沈阳人，大学本科，从事疫苗生产相关工作