利用生存分析方法研究乳腺癌中HER2蛋白表达水平与疾病进展的关联性

利用生存分析方法研究乳腺癌中HER2蛋白表达水平与疾病进展的关联性

王玮1     ,樊龙刚2通讯作者, 

1. 新疆肿瘤医院   新疆   830000
2. 乌鲁木齐经济技术开发区（头屯河区）畜牧兽医站  新疆    830000

摘 要：目的 本研究旨在利用生存分析方法探究Her2蛋白表达水平与乳腺癌的疾病进展关联性。方法 选取某医院近5年的100例确诊为原发性乳腺癌的患者进行研究，通过PCR技术研究乳腺癌样本中Her基因水平，使用免疫组织化学分析乳腺癌样本中Her2蛋白的表达，并对患者5年的生存时间进行随访，分析对比Her2基因水平及蛋白的表达与乳腺癌转移和患者预后关系。结果检测的100例乳腺癌患者中，Her2蛋白阳性表达有55例（55%），同生存率曲线相关比较，统计学有显著差异（P＜0.05）。同时Her2蛋白阳性表达患者的肿瘤分化程度差、大于5年的生存率低（P＜0.05），结论 Her2蛋白表达水平与原发性乳腺癌患者的生存时间、复发转移率密切相关。检测蛋白的阳性表达水平可作为乳腺癌预后的参考指标，其中Her2高表达提示预后不良。

关键词：乳腺癌；HER2蛋白；生存时间；预后

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，Her2受体是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，激活时会影响乳腺癌细胞增殖和存活，约15%~20%的乳腺癌中Her2过表达[1-2]。过表达的HER2受体与乳腺癌患者临床上复发、转移以及不良预后密切相关，是一种有价值的治疗靶点。然而，Her2阳性条件下乳腺癌患者才能采用Her2基因靶向治疗，因此，对Her2蛋白表达水平进行分析，研究同乳腺癌疾病进程的相关性至关重要。2007年美国临床肿瘤学会（ASCO）指南规定，应在诊断或复发时对每种浸润性乳腺癌进行 Her2评估，以指导治疗[3]。基于此，本研究将通过生存分析方法研究乳腺癌中Her2蛋白表达水平与疾病进展的关联性。

1资料与方法

1.1一般资料

选取本院2018年8月-2023年6月期间收治并经手术根治切除肿瘤的100例原发性乳腺癌患者进行随访，患者本人同意并签署知情同意书。所有患者均有医学诊断为乳腺癌且全部患者术前未经化疗或放疗。乳腺癌患者均为女性，年龄29~65岁，平均49.8岁。随访资料截至2023年6月，其中生存期计算为手术日期到随访截止日期，复发转移发生时，生存日期为转移至死亡日期为止。手术根治切除的乳腺癌组织经10%福尔马林固定后用免疫荧光，免疫组织化学法等进行分析。

1.2检测方法及原理

主要包含免疫组织化学（immunohistochemis-try，IHC）检测HER2蛋白的表达水平和原位杂交法（in situ hybridization，ISH）检测HER2基因扩增水平[4]。原位杂交法包括荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和亮视野原位杂交。PCR技术与蛋白印记法分别检测Her2 mRNA与蛋白水平。

1.2.1 PCR技术

采用TRIzol法常规提取组织中总RNA，提取的总RNA用脱氧核糖核酸酶I去除基因组DNA。按照逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应，反应条件为：70℃ 10min，冰上5min，42℃ 60min，95℃ 5min，0℃ 5min。荧光定量PCR反应体系为25μl，内含500ng cDNA模板、250nmol／L上、下游引物及12.5μl的2×SYBR Green PCRMaster混合物。将反应管置入MX3000P Realtime PCR反应仪中，反应条件为：94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 40s，45个循环，荧光信号监测。以2-ΔΔCt值表示基因的相对表达量，ct值代表在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环次数，ΔΔCt=待测样本（Ct Her2-CtGAPDH）-对照组(Ct Her2-Ct GADPH)。

1.2.2 蛋白印记实验

提取组织总蛋白，使用BCA蛋白浓度试剂盒对其进行蛋白定量，并使用溴酚指示剂制备SDS-PAGE电泳样品。选取5%的浓缩胶和10%的分离胶，取20μL蛋白样品进行上样，电泳结束后，将蛋白在200mA恒流的条件下电转90min转移至PVDF膜上。使用10%的脱脂乳粉溶液对PVDF膜进行封闭2h后，加入Her2单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜。使用TBST洗膜3次，每次15min，将膜与二抗在室温孵育2h，用TBST洗膜三次，使用ECL化学发光液对蛋白进行显色成像

1.2.3免疫组织化学 (IHC)

使用En Vision法和高质量的DAB显色液及标准的试剂盒，每个染色步骤应有严格的质量控制，尤其需要设立阳性对照、阴性对照和空白对照，被检测切片中癌旁正常乳腺组织可以作为内对照。结果判断时以细胞膜完全着色的癌细胞所占比例和着色强度为依据，并且只评定浸润性癌的着色情况，正常乳腺上皮细胞应不着色。结果判定以大于10%的肿瘤细胞呈现强的、完整的细胞膜着色视为Her2受体的高表达。

1.2.4 荧光原位杂交 (FISH)

目前应用FISH法检测Her2基因状态的探针，多是同时含有HER2基因(标记为橘红色荧光)和该基因所在的17号着丝粒(标记为绿色荧光)序列的混合探针。杂交组织或细胞中有75%的细胞核显示出双色信号时，认定实验成功，并且红、绿信号互为对照，癌与非癌细胞可以互为对照。同时应选择FISH阳性和阴性的标本片探针公司提供对照片)作为外对照。结果判读的意义，在于当HER2基因(红色信号)与17号染色体的数目(绿色信号)比值大于2时，即为HER2基因扩增。若红绿信号比值在1.8 ~2.2之间，则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。结果仍然为临界值时，应在FISH检验报告中注明。有时HER2基因扩增在不同区域癌细胞核中存在异质性时，应在另一异质性癌的区域再计数20 ~30个细胞核内的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释。

1.3统计分析

对所有数据进行整理后，计量资料以Mean ± s.d.的形式表示，采用t检验对数据进行分析比较。计数资料以n的形式表示，采用χ2检验对数据进行分析比较。以P<0.05表示结果具有统计学差异。

2结果

2.1 Her2表达水平与临床疗效对比

通过IHC检测Her2蛋白表达情况，结果显示100例乳腺癌临床标本中，IHC检测Her2呈阳性（+++）的有4例（4%）；呈阴性（+/－）13例（13%）；剩余83例均为Her2不确定（++），占总样品的83%。表1。PCR技术与蛋白印记法测得Her2 mRNA表达水平为1±0.29，蛋白表达水平为0.58±0.15。

通过FISH检测Her2基因扩增情况，采用Kappa值分析结果显示，70%有Her2基因扩增，其中Her2蛋白水平呈阳性的4例均表达Her2基因扩增。Her2蛋白水平（++）组中仅有61例有Her2基因扩增，占该组83例样本中的73.49%；而Her2阴性（+/－）的13例中也有4例有显著的Her2基因扩增（30.77%）。综上所述，Her2基因阳性有69例，而31例为Her2（﹣）。

2.2 Her2基因扩增与乳腺癌临床病理指标的关系

Her2蛋白表达水平分别与乳腺癌组织学分级、临床分期、淋巴结转移及 ER 和PR 蛋白表达呈显著相关性，其中Her2基因扩增阳性69例(69%)，同ER和PR阴性状态分析（X2ER=13.00, X2PR=5.315, P<0.05）。同时ER﹣/PR﹣的50例中Her2基因扩增的有47例；而ER+PR+的36例中有16例Her2基因扩增。最后同肿瘤组织学类型研究发现与肿瘤组织学类型无关。

2.3 Her2蛋白表达与乳腺癌的复发和转移关系

Her2阳性患者共69例，其中37例复发转移，复发转移率为53.62%；Her2阳性的31例患者中，仅出现8例，复发转移率为25.80%，对比发现前者明显高于后者（P<0.05）,即Her2阳性表达的患者更容易发生乳腺癌的复发和转移。

表1 两组不良反应与复发情况比较

讨论

乳腺是依赖激素分泌的器官，而ER、PR的蛋白表达是乳腺癌患者预后的重要指标[5]，当ER、PR为阴性时，患者的预后情况不良。据文献报道ER、PR和Her-2通过不同的机制抑制USP15介导的PARP1稳定。ER与USP15启动子结合以抑制其表达，PR抑制USP15的去泛素化酶活性，而Her-2减弱了PARP1-USP15的相互作用[6]。乳腺癌中这三种受体的特异性缺失导致PARP1水平升高，从而增加碱基切除修复和女性乳腺细胞存活率。本结果研究显示，ER和PR表达与Her-2基因扩增呈负相关，同王鸿雁[7]等报道的结果一致。乳腺癌存在Her-2 表达/扩增异质性，其发生率为1%-40%[8]。据文献报道，Her-2表达扩增的异质性具有三种主要模式:其中包括两种不同的肿瘤细胞克隆，一种携带Her-2扩增，另一种具有正常的 Her-2 表达状态，即“聚集型或克隆型”，最后一种也是最为常见的模式，即Her-2阴性肿瘤细胞群中具有不同Her-2表达状态的混杂细胞，可以是弥漫性的，也可以是仅有分散的分离Her-2扩增细胞(“镶嵌型”)[9]。同时本研究结果表明69例Her2蛋白高表达的患者预后和复发转移率显著高于Her2呈阴性的患者，具有更高的临床分期、肿瘤分化更差、以及淋巴结转移率高。证明了Her2蛋白表达与乳腺癌临床分期、组织学分级、淋巴结转移的显著相关性。综上所述，Her2蛋白表达水平可作为乳腺癌预后的参考指标,并成为乳腺癌治疗的分子靶点。

参考文献 

1.岳萌,吴偲,王心然,等. 微浸润及T1a期乳腺癌中HER-2(0)和(1+)的临床意义及预后分析[J]. 临床与实验病理学杂志,2023,39(1):42-46,52.

2.Cuadros M, Villegas R. Systematic review of HER2 breast cancer testing[J]. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology, 2009, 17(1): 1-7.

3.Costa R L B, Czerniecki B J. Clinical development of immunotherapies for HER2+ breast cancer: a review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond[J]. NPJ Breast Cancer, 2020, 6(1): 10.

4.朱晓莹,林洁,王兴枝子,等.IHC与FISH检测浸润性乳腺癌患者HER2蛋白表达和基因扩增的差异性分析[J]. 现代肿瘤医学,2021,29(8):1320-1324.

5.甄勇,郝建萍,李瑞霞,等.HER1和HER2蛋白表达与乳腺癌的相关性分析[J].全文版:医药卫生, 2016, 000(005):P.33-34.

6.Sun, X., Tang, H., Chen, Y. et al. Loss of the receptors ER, PR and HER2 promotes USP15-dependent stabilization of PARP1 in triple-negative breast cancer[J]. Nat Cancer 4, 2023, 716–733.

7.王鸿雁，张学斌，蒋伊娜，等.乳腺癌HER-2基因扩增的临床病理意义.肿瘤防治研究，2010，37 (11) : 1264-1268.

8.Spring, L.M., Han, H., Liu, M.C. et al. Author Correction: Neoadjuvant study of niraparib in patients with HER2-negative, BRCA-mutated, resectable breast cancer[J]. Nat Cancer, 2022, 3, 1138.

9.Dogan, I., Aydin, E., Khanmammadov, N. et al. Termination of trastuzumab in HER2-positive metastatic breast cancer patients who received trastuzumab beyond progression[J]. Sci Rep, 2023, 13, 8779.