脓液中检出1株惰性凝聚杆菌

脓液中检出1株惰性凝聚杆菌

王周宝，*李文波，郭雅琼，王玥，马玉琴

甘肃省第二人民医院，甘肃兰州730000

摘要：惰性凝聚杆菌(A.segnis)属于凝聚杆菌属(Aggregatibacter)[1]该属包括嗜沫凝聚杆菌（A.aphrophilus)、副嗜沫凝聚杆菌(A.paraphrophilus)、惰性凝聚杆菌(A.segnis)。凝聚杆菌是一类生长需特殊营养物质的苛养菌,与很多感染性疾病有关，可导致人类严重感染的革兰阴性菌。在临床标本中该菌属细菌不容易分离及鉴定，故又称“难培养的细菌”，常规培养基生长困难或需长时间的培养才能检测到，引起的感染发病率一直难以估计。因此，对苛氧性细菌的分离鉴定和药敏试验既是临床抗感染治疗的迫切需要，也是对微生物人员实验室检测技术能力的考验。本文就本院肝病区脾脓肿患者的临床资料,对惰性凝聚杆菌的生物学特性、实验室细菌鉴定及药敏进行分析总结如下。

关键词：惰性凝聚杆菌；脓肿；感染；

1.患者资料:感染科患者，女，噬血细胞综合征，2021年7月12日因自觉受凉后出现发热，伴乏力、纳差，感全身肌肉酸困，无咳痰、头晕、头疼。自行服阿莫西林胶囊药物未见改善，就诊于陇南市第一人民医院，行血常规1.02×109/L，血小板10.00×109/L，中性粒细胞绝对值0.48×109/L，红细胞3.1×1012/L，血红蛋白浓度93g/L.腹部彩超及骨髓穿刺活检术后，诊断噬血细胞综合征，因该院无治疗噬血细胞综合征的药物，7月21号转诊于舟曲县人民医院，拟诊噬血细胞综合征，给予“葡萄糖酸锑钠”诊断性治疗，7天后仍高烧、乏力，病情进一步加重，8月11号血液常规检测：全血白细胞减少1.34×109/L，血小板8.00×109/L，于8月15行选择性部分脾动脉栓塞术，给予“依托泊苷+地塞米松+环孢素胶囊”诱导化疗，2021.8.22脾出现脓肿，并辅抗感染、保肝、调节肠道菌群、补充维生素，调节免疫等对症处理，于2021年08.24行脾脓肿引流术，并辅以抗感染、保肝等对症治疗，2021.11.4结束诱导化疗，11月28日复检血常规指标均正常，白细胞5.02×109/L，血小板126.0×109/L，症状改善，于12.29日带脾脓肿引流管出院,院外持续引流，平均每天引流出淡黄色脓性液体约70ml。2022年1月13日为求后续维持化疗再来我院就诊，门诊以“噬血细胞综合征,脾脓肿”收住我院肝病科。实验室检查：血常规：白细胞7.14×109/L，NO:75.2%,PCT:0.22ng/ml,CRP:126.2mg/L,ALT:40.6U/L,AST:41.0 U/L,碱性磷酸酶：77.0 U/L,γ--GT:145.0 U/L ，肾功、心肌酶谱、凝血七项检测均无异常。体格检查：37.1度，神志清楚，心律齐，各瓣膜听诊区未闻及杂音；双肺呼吸音较粗，可闻及干啰音；全身浅表淋巴结未触及肿大；肠鸣音正常，双下肢没有出现水肿。腹部平坦且比较柔软，穿刺处的敷料干燥未见渗血、渗液，无压痛、反跳痛，腹部无包块。肝脏肋缘及剑突下未触及，脾脏肿大，肋下触及4横指，边缘圆钝，质韧。腹部彩超：脾下极混合回声，针对脾脓肿（46X47mm）。继续引流， 脾脓肿引流出淡黄色混浊液体为脓性，立即将标本送检验科微生物实验室进行细菌培养，将标本接种血平板、巧克力平板、沙保弱若平板，放5%二氧化碳条件下35℃孵育，由于专业人员技术能力不足，未做直接涂片检查。24小时未见细菌生长，实验室负责人跟临床沟通后分析考虑可能是苛氧性细菌，培养时间短，也有可能是标本留取不合格原因，继续培养，同时，建议临床继续送检。第二天，临床听取微生物检验人员建议将脓性标本留取并同时送检2份标本，1份注入血培养需氧瓶及兼性厌氧瓶中进行增菌培养，另一份进行直接涂片进行革兰染色镜检，同时接种培养基进行细菌、真菌培养。直接镜检发现革兰阴性小杆菌++，24小时全自动培养仪需氧瓶及厌氧瓶同时报警阳性，转种血平板、巧克力平板，5%二氧化碳CO2条件下培养24h后血平板及巧克力平板均有菌落生长，菌落细小，不溶血；巧克力平板上菌落生长相对较好，考虑是兼性厌氧菌，经过微生物实验室最终鉴定为惰性凝聚杆菌。本实验室未开展厌氧菌培养。。

2.细菌学检验及鉴定

2.1生物学特性[2]

凝聚杆菌属细菌为革兰阴性短小杆菌，无芽孢，无动力，兼性厌氧,呈高度的异质性，多为动物病原菌，寄生在人和哺乳动物的消化道、呼吸道、泌尿道粘膜表面。在出现创伤或粘膜破损时侵入健康组织引起感染性疾病，可引起心内膜炎、软组织感染、心包炎、肺炎、菌血症、败血症、尿路感染及各种脓肿。从病灶中新分离出的菌株多呈球杆菌、双球菌或短链状，在陈旧培养物中呈多形性（长丝状），该菌对营养要求较高，生长需血液中的生长因子，X、V因子或二者之一，5-10%CO2中生长良好，不能在含有完整的红细胞羊血琼脂培养基生长，而在巧克力琼脂平板生长分离良好，在兔血巧克力培养基中生长优于羊血巧克力平板。在巧克力琼脂培养基上孵育可形成直径1-2mm大小的菌落，菌落为圆形、湿润、光滑、透明或半透明（露滴样）、无色至灰白色的菌落，有荚膜的菌落可呈粘液性菌落。可发酵葡萄糖，产酸、产气能还原硝酸盐为亚硝酸盐。

2.2细菌鉴定

形态与染色：检验科微生物室接到临床送检的一份脾脓肿脓液标本未做涂片镜检，直接接种血平板、巧克力平板、沙堡弱平板24小时后均未见细菌、真菌生长。同时联系临床沟通后建议再送标本并注入血培养瓶中增菌培养，同时做脓液标本直接涂片进行革兰染色，镜下可见大量白细胞及革兰染色双小球杆菌、小杆菌（图1）。再次送检标本注入血培养瓶中增菌培养，全自动培养箱仪第二天厌氧培养瓶、需氧瓶均提示阳性（由于时间太长，具体时间记不清楚了，但确实是真实案例），随立即转种血平板、巧克力平板、麦康凯平板及沙包弱平板放于5-10%CO2培养箱中进行培养，又经过24小时培养后发现，厌氧、需氧培养瓶分别接种在嗜血巧克力平板生长出肉眼可见少量小菌落，48小时生长出湿润呈水滴状单个纯菌落如下图2，厌氧瓶转种培养基菌落生长优于需氧瓶。嗜血巧克力平板菌落进行革兰染色为革兰阴性双球杆菌、成对排列，如下图3，在血琼脂平板上生长不良，几乎看不到的菌落，只可见薄薄的细沙样，刮取染色镜下可见革兰阴性球杆菌及小杆菌如下图4。72小时需氧培养瓶转种，生长肉眼可见菌落，但菌落小而少，而且同一时间在巧克力平板菌落生长优于血平板，提示此菌生长可能需X或V因子及5-10%CO2环境，是一株兼性厌氧菌。菌落氧化酶、触酶阳性，从菌落形态及革兰染色上高度怀疑是嗜血杆菌属。ATB鉴定仪ID32E板条不能识别，随后经过卫星试验（+），一系列的生化反应（手工鉴定微量肉汤管购于杭州天河微生物有限公司）微量管：葡萄糖（+）、蔗糖（+）、乳糖（-）、甘露糖（-）、木糖（-），X因子（-）、V因子（+），初步鉴定为惰性嗜血杆菌。再次使用ID32GN板条(革兰阴性菌本室只有肠杆菌科和革兰阴性杆菌板条)采用法国梅里埃ATB细菌鉴定仪鉴定为脑膜炎奈瑟菌，鉴定百分率为87.0%，鉴定率虽高，但鉴定结果与培养菌落及镜下形态不符。为准确鉴定菌种随后又联系兰州大学第一医院检验科通过VITEK MS质谱仪最终鉴定为惰性嗜血杆菌（惰性凝聚杆菌），鉴定率百分率为99.9%，。与实验室手工鉴定菌种一致，立即与临床沟通进行药敏试验。第一次送检标本继续培养后未生长细菌，分析原因可能临床标本留取不合格，以第二次送检标本培养结果为主。

2.3药敏试验结果：

本报告药敏试验采用纸片琼脂扩散法（K-B法）进行体外药敏试验，按照全国临床检验操作规程进行操作，根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）M45标准判读（药敏试验参照不常见或苛养菌药敏方法进行CLSIM45-A3，HACEK群药敏试验解释标准进行）。嗜血杆菌药敏试验培养基（HTM）购于温州市廉泰生物科技有限公司，生产批号：VC0110P,药敏纸片购于赛默飞世尔科技有限公司，产品注册证号：国械注进20172401720。本例惰性凝聚杆菌对大多数抗菌药物敏感，对青霉素、克拉霉素、阿奇霉素耐，对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、复方磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、四环素、氯霉素、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南、亚胺培南均敏感。其中复方磺胺甲恶唑和头孢曲松药敏折点折点显示抗菌活性较好，故建议临床视情况采用复方磺胺甲恶唑联合头孢曲松进行抗感染治疗。

结论：

惰性凝聚杆菌，广泛寄居于人类口腔、上呼吸道和消化道。是人类口腔咽部的共生菌，与细胞结构具有粘附性，可以和其他细菌并存，因而导致牙菌斑。在罕见情况下才会导致侵入性菌血症，引起亚急性心内膜炎、脑脓肿、骨髓炎和泌尿生殖道感染等。惰性凝聚杆菌较少入血引起肺部化脓性感染。有研究显示，李梅等从眼分泌物标本中分离出2株惰性凝聚杆菌[3]，刘晓富等从乳腺农业中分离出1株伴放线菌凝聚杆菌[4]。张之峰等从细菌性心内膜炎患者血液标本中检出1例伴放线菌凝聚杆菌。本例患者为惰性凝聚杆菌感染合并脾脓肿，既往相关报道较少，惰性凝聚杆菌是少见的致病菌，属于营养要求较高的苛养菌，本例标本放入血培养瓶中增菌培养24小时候全自动梅里埃血培养仪提示阳性，经过5%CO2环境下24小时培养后，在血平板中生长很难辨认的细小菌落，嗜血巧克力屏蔽生长肉眼可见、少量的水滴状小菌落，生长不良，48小时候嗜血巧克力平板生长良好。此菌在普通细菌培养中如果放置时间不够长很难分离到，极易漏检。目前在临床标本中检出比较少见，而且鉴定比较困难，用ATB肠杆菌科板条读取不出，由于专业技术能力不足，选错ATB鉴定板条。革兰阴性杆菌鉴定板读取错误，分析原因可能是因为是由血培养瓶转种在培养基上进行繁殖，培养瓶内成分对鉴定有干扰。通过培养基生长菌落形态及革兰染色镜下菌体形态，生化反应，不能准确鉴定菌种，只好能借助于微生物鉴定先进高科技技术，飞行质谱仪进行鉴定。本实验室检出的本例菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、复方磺胺甲恶唑、头孢吡肟、左氧氟沙星、四环素、氯霉素、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南、亚胺培南均具有抗菌活性。由于实验室没有

β-内酰胺酶检测试纸，本例菌株未做β-内酰胺酶检测。

通过本案例发现，临床凝聚杆菌的感染时有发生，但此菌分离培养较为困难，在常规培养基上生长困难或不生长，而且需要长时间培养才能培养出菌。培养时间短，容易造成漏检，手工鉴定耗时费力。目前由这类细菌引起的感染随着微生物实验室水平不断提高，正越来越多地被发现，为提高临床抗感染治疗及诊断，临床微生物实验室应引进更先进的细菌鉴定设备，快速准确进行细菌菌种鉴定，微生物专业人员的培训力度也应不断加强，提高本专业的技术能力，更好的为临床抗感染治疗服务。

参考文献：

[1]李梅，郭映辉，张文超，翟玉磊.VITEK MS鉴定惰性凝聚杆菌2例报道[J].检验医学，2021，36（1）：114-116.

[2]陈东科，孙长贵主编，实用临床微生物学检验与图谱[M].人民卫生出版社，2013年9月第一版，468-476.

[3]刘晓富，朱亚宝.自乳腺脓液中分离出伴放线菌凝聚杆菌1例[J].临床检验杂志，2011，29（3）：213.

[4]张之峰，周万春.由伴放线凝聚杆菌引起细菌性心内膜炎患者1例[J].临床输血与检验，2015，17（5）：467-468.

第一作者简介：王周宝，本科，主管检验医师，从事临床微生物细菌耐药及医院感染。

*通讯作者：李文波，本科，副主任检验技师，从事临床微生物细菌耐药及医院感染。