二甲双胍通过抑制老龄小鼠脑缺血后的炎症水平恢复神经功能

二甲双胍通过抑制老龄小鼠脑缺血后的炎症水平恢复神经功能

王强, ,张海涛通讯作者

空军军医大学第二附属医院神经外科  陕西 西安 710000 空军军医大学第二附属医院呼吸与危重症医学科 陕西 西安 710000

摘要：目的：探讨二甲双胍对脑缺血老龄小鼠神经功能的保护作用及机制。方法：选择健康老龄的C57小鼠，随机分为假手术组，缺血组，脑缺血+二甲双胍治疗组，后两者采用光化学法建立脑缺血模型，采用TTC法观察脑缺血小鼠的梗死体积，采用水迷宫法观察小鼠的空间记忆功能，采用ELISA法测定梗死周围组织的IL18，TNFα和IL1β表达水平，通过WB检测细胞内的TLR4/NF-κB通路改变。结果：二甲双胍能显著减少脑梗死体积并恢复小鼠的空间记忆能力，机制研究表明脑梗死组织中的炎症分子表达降低，通路实验表明二甲双胍是治疗后TLR4/NF-κB通路受到了抑制。结论：二甲双胍通过抑制老龄小鼠脑缺血后的炎症水平恢复神经功能。

关键词：二甲双胍，炎症，脑缺血，神经功能

前言：缺血性脑卒中具有发病率、致死率和致残率高的特点，其中大部分患者为超过70岁的老年人，因此缺血脑卒中是危害老年人健康和生活质量的重要杀手。缺血性脑卒中发生后，在缺血灶周围会发生炎症，血脑屏障损坏，细胞凋亡和细胞坏死等多种病理生理学进程，其中炎症被认为是影响脑缺血患者预后最重要的继发性损害，抑制炎症将有效降低脑缺血的致死率和致残率。二甲双胍是一种用于II型糖尿病与代谢综合症的双胍类药物，已有实验证明二甲双胍具有抗氧化，抗肿瘤，抗凋亡和抗炎等多种药理学作用，在多种疾病中具有重要的应用价值。然而在缺血性卒中的老龄小鼠中，二甲双胍的作用和机制还未见报道。

方法：

动物

C57小鼠由空军军医大学实验动物中心提供，10月龄，雄性，体重为20-25g，本实验共使用了36只小鼠，随机分为3组：假手术组，脑缺血组和脑缺血+二甲双胍治疗组，每组3只小鼠。本研究中所有实验动物操作均满足空军军医大学伦理委员会的批准，动物批号：TDLL2018-13-190。

脑出血造模

静脉注射玫瑰红（50 mg/kg）3 min 后，使用戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，将其固定在立体定位仪上，充分暴露头骨。用直径为2.5 mm的冷光源垂直贴于颅骨上方，并使其正中位置位于前囟向右1.5 mm处，冷光源照射10 min后缝合头皮并消毒，操作结束后将动物放至37℃恒温动物板上，细心监护直至动物苏醒。

TTC染色

脑缺血造模7天后，每组各取3只小鼠腹腔深度麻醉后取脑，切片后加入适量的2% TTC染液、在37 ℃恒温水浴箱中进行避光染色， 30 min后终止染色，在多聚甲醛中固定 24h后拍照。使用Image-Pro Plus6. 0软件分析梗死体积。

水迷宫实验

每组3只小鼠在术后第7天开始进行行为学测试。水迷宫为直径145cm的圆柱形水池，水温保持在22±0.5℃，并保持周围环境安静，第3天为适应性训练，第4~7天作为正式实验。

ELISA检测

每组3只小鼠深度麻醉后取脑，收集损伤周边脑组织，充分剪碎碾磨并加入蛋白裂解液，冰上裂解30min后1 000×g 离心20 min，获得蛋白样本。参考ELISA试剂盒中的说明书，检测梗死脑组织中的TNFα，IL-18和IL-1β的表达水平。

WB

每组3只小鼠深度麻醉后取脑，收集损伤周边脑组织，充分剪碎碾磨并加入蛋白裂解液，冰上裂解30min后，在4℃下1 000×g离心20 min，获得裂解蛋白，95℃变性 10min。取10ul样品进行凝胶电泳，转膜、封闭后，加入一抗：TLR4（1∶1 000）、NF-κB（1∶1000）、β-actin（1∶3000），4℃过夜，然后加入相应的二抗，在室温下孵育2h，采用Image J图像分析系统对各条带对应的灰度值进行统计分析。

统计

使用Graphpad Prism 8.0软件对数据进行统计分析以及绘图。各组计量数据以均数±标准差表示，采用One-way ANOVA 检验比较三组间的差异水平，当P<0.05认为差异具有统计学意义。

结果：

1、二甲双胍可以减少脑缺血的梗死面积

与假手术组相比，TTC染色结果显示脑缺血组小鼠的梗死体积显著增加，统计表明差异具有统计学意义（P<0.05）；与脑缺血组相比，在接受二甲双胍治疗后，小鼠的梗死体积显著减少，统计表明差异具有统计意义（P<0.05），结果见图1。

图1 假手术组，脑缺血组和脑缺血+二甲双胍治疗组梗死体积

2、二甲双胍改善小鼠的空间记忆功能

与假手术组相比，水迷宫实验结果显示脑缺血组小鼠在原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数显著减少，统计表明差异具有统计学意义（P<0.05）；与脑缺血组相比，在接受二甲双胍治疗后，小鼠在原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数显著增加，统计表明差异具有统计意义（P<0.05），结果见表1。

表1假手术组，脑缺血组和脑缺血+二甲双胍治疗组小鼠在原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数。

3、二甲双胍可以减少炎症分子表达水平

ELISA实验结果显示与假手术组相比，脑缺血组小鼠梗死周围脑组织的炎症分子：TNFα，IL-18和IL-1β的表达水平显著上升，统计表明差异具有统计学意义（P<0.05）；与脑缺血组相比，在接受二甲双胍治疗后，小鼠梗死周围脑组织的TNFα，IL-18和IL-1β的表达水平显著下降，统计表明差异具有统计学意义（P<0.05），结果见表2。

表2 假手术组，脑缺血组和脑缺血+二甲双胍治疗组小鼠梗死周围组织的TNFα，IL-18和IL-1β表达水平

4、二甲双胍引起TLR4/NF-κB通路发生改变梗死周围脑组织

WB实验结果显示与假手术组相比，脑缺血组小鼠梗死周围脑组织的TLR4和NF-κB的表达水平显著上升，统计表明差异具有统计学意义（P<0.05）；与脑缺血组相比，在接受二甲双胍治疗后，小鼠梗死周围脑组织的TLR4和NF-κB的表达水平显著下降，统计表明差异具有统计学意义（P<0.05），结果见图2。

图2 假手术组，脑缺血组和脑缺血+二甲双胍治疗组脑组织中TLR4/NF-κB变化水平

讨论：

脑缺血的预后差，而且多发生于老年人群体中，目前针对脑缺血的治疗方式仍然以外科治疗为主，而面对炎症等继发性损伤，尚缺乏有效的治疗方法。二甲双胍在多种疾病中发挥重要的药理学功能，在中枢神经系统中二甲双胍可以起到抗凋亡，抗氧化应激和抗肿瘤的作用。然而在老年脑缺血小鼠中，二甲双胍的药理学作用还不明确，本研究从组织形态学，动物行为学和分子生物学等多个角度证明了二甲双胍通过抑制脑缺血炎症水平，发挥神经保护的作用。

脑缺血发生后会刺激损伤周围脑组织产生炎症反应，炎症反应被认为是脑缺血损伤的重要的损伤因素之一，炎症的严重程度与损伤的体积有关。在使用二甲双胍腹腔治疗后，脑缺血小鼠的梗死体积显著减少；水迷宫是反应啮齿类动物空间学习记忆重要的行为学范式之一，我们的实验结果显示，脑缺血小鼠的空间记忆学习记忆在接受二甲双胍腹腔注射后得到了显著恢复。

损伤周边组织会分泌一系列有害炎症因子如：IL18，TNFα和IL1β等，导致细胞进一步凋亡，加重神经功能的损害，我们对损伤周边的分子生物学实验结果表明，炎症分子的表达水平显著降低了，提示脑组织周围的炎症水平显著降低。当脑组织发生损伤后，损伤周边组织的TLR4/NF-κB通路会被激活，并引起下游的炎症因子释放和合成，本实验结果表明脑缺血小鼠接受二甲双胍治疗后TLR4/NF-κB的表达水平显著降低了，提示二甲双胍可能是通过TLR4/NF-κB通路发挥的作用的，与既往的研究一致。

综上所述，二甲双胍可以通过TLR4/NF-κB通路抑制损伤周边脑组织的炎症分子分泌，减少老年脑缺血小鼠的梗死体积，发挥改善空间学习记忆的作用。

参考文献：

1. GUZIK A, BUSHNELL C: Stroke Epidemiology and Risk Factor Management. Continuum (Minneap Minn) 2017, 23(1, Cerebrovascular Disease):15-39.

2.FLORY J, LIPSKA K: Metformin in 2019. JAMA 2019, 321(19):1926-1927.

基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（82171489）；

国家自然科学基金青年资助项目（82103537）；

通讯作者：张海涛，博士，从事肺癌脑转移与脑免疫微环境的机制研究

邮箱：zht_best@163.com 地址：空军军医大学第二附属医院