虎奶菇水溶和碱溶多糖的超滤纯化及其体外抗氧化活性研究

虎奶菇水溶和碱溶多糖的超滤纯化及其体外抗氧化活性研究

王爽1,王慧宾1,邓朝阳1,方金山2,方婷2,江国志2

(1 江西省科学院应用化学研究所，江西南昌；2 抚州市临川金山生物科技有限公司，江西抚州）

摘要： 虎奶菇是一种可药食两用的食用菌种，其活性多糖具有提高机体免疫力等多种生物活性。通过超滤技术分别对水提取和碱提取得到的虎奶菇多糖进行了除杂和分子量分级，得到纯化的虎奶菇多糖产品。对水溶和碱溶两种多糖进行了初步的体外抗氧化活性评价，发现碱提虎奶菇多糖的超氧自由基清除活性好于水提多糖，两种多糖的羟基自由基清除活性能力相当，且虎奶菇多糖的抗氧化活性呈现一定的浓度依赖性。

关键词： 虎奶菇多糖；超滤纯化；抗氧化活性

基金项目：江西省重点研发计划项目（20203BBFL63061，20192BBFL60029）；江西省科学院包干制项目（2021YSBG22014，2022YSBZ22026）。

虎奶菇（pleurotus tuber – regium(Fr.)Sing），又名虎奶菌，虎乳菌等，是担子菌亚门、侧耳科、侧耳属中的一种大型真菌，其成熟菌核比较大，因此又名菌核侧耳。虎奶菇喜温热环境，在我国南方、非洲、东南亚等地有野生资源。虎奶菇中具有丰富的蛋白质、多糖、氨基酸、多酚、皂苷等营养和活性成分[1-2]。研究发现虎奶菇具有治疗哮喘、提高免疫力、降血糖等药理活性，而其中多糖是虎奶菇中一种重要的活性成分。对虎奶菇多糖的提取、纯化和活性研究有一定的文献报道。本文主要研究了虎奶菇水溶性和碱溶性多糖的提取和超滤纯化工艺，并对两种虎奶菇多糖的抗氧化活性进行了初步比较。

1 材料与仪器

虎奶菇菌核（抚州市临川金山生物科技有限公司）；氢氧化钠、乙醇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸等，均为国产分析纯试剂。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，还原型辅酶I 二钠(β-NADH)，吩嗪硫酸甲酯（PMS），均为国产生物技术级试剂。

紫外可见分光光度计（TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司），有机超滤膜元件及装置（济南博纳生物技术有限公司）。其它设备为实验室常用设备。

2 方法

2.1 虎奶菇水溶性多糖提取液的制备

虎奶菇首先用中药粉碎机粉碎成80目以上的粉末，然后用85％的乙醇进行脱脂处理。脱脂后的虎奶菇粉末去除了酯类和色素等杂质，使其更易分散在水中，有利于虎奶菇多糖的溶出，能够有效提高提取效率以及减轻后续的除杂难度。脱脂后的虎奶菇粉末置于恒温干燥箱中在50℃条件下烘干至恒重，置干燥器中备用。

水提多糖采用我们优化后的工艺[3]，即按料液比1:20(g/mL)添加纯净水，在90℃以上的热水中持续磁力搅拌2h，冷至室温后，4000rpm条件下离心得到上清液即为虎奶菇水溶性多糖提取液。重复提取1次，以充分将水溶性多糖提取出来。

2.2 虎奶菇碱溶性多糖提取液的制备

水提后的虎奶菇粉末残渣，以料液比1:10(g/mL)添加0.3 M的氢氧化钠溶液，于常温下（25℃左右）进行磁力搅拌2h。随后，在4000rpm条件下离心，得到虎奶菇碱溶多糖提取液，重复提取1次，合并上清液。上清液用5 M的盐酸溶液中和至pH为7，使其成为中性溶液。

2.3 虎奶菇多糖提取液的超滤纯化

超滤工艺采用截留分子量为10kDa的卷式膜装置对虎奶菇多糖溶液进行纯化除杂。具体操作步骤如下，安装好合适的卷式超滤膜后，关闭物料出口，将压力开关调至最大，将多糖溶液在室温下加入物料罐，开启电源，压力泵随即开始工作。随着超滤的进行，物料罐中的截留液慢慢变少，透过液慢慢变多。达到一定浓缩程度后，补充多糖溶液继续超滤，多糖溶液全部加入物料罐后，观察截留液情况，水位降至物料罐的1/5时，关闭电源，打开物料出口开关，收集截留液。随后重新开启电源，加入纯净水洗涤超滤膜，重复3次，将所有截留液合并，得到纯化后的虎奶菇多糖溶液。

2.4 虎奶菇水溶多糖和碱溶多糖的抗氧化活性

2.4.1 超氧自由基清除测试

超滤浓缩液加水配制成不同浓度的水提和碱提虎奶菇多糖溶液（1、2、3、4、5 mg/mL），置于25mL比色管中，依次加入1 mL NBT溶液、NADH溶液和PMS溶液[4]，混匀，于室温下（25℃）暗处静置10min后，在紫外可见分光光度计上测定560nm处的吸光度值。以纯净水代替多糖溶液做空白对照。超氧自由基清除活性计算公式为：清除率（％）=[1-A1/A0]*100%，其中A0为对照吸光度值，A1为多糖样品的吸光度值。

2.4.2 羟基自由基清除测试

超滤浓缩液加水配制成不同浓度的水提和碱提虎奶菇多糖溶液（0.125、0.25、0.5、1 mg/mL），置于25mL比色管中，依次加入0.3 mL 硫酸亚铁、0.25mL双氧水、1mL水杨酸[5]，在37℃恒温水浴中静置30min，随后定容bing 测定510nm处的吸光度值，计算清除率。

3 结果和讨论

3.1 虎奶菇多糖的超滤纯化工艺分析

虎奶菇中有丰富的三萜皂苷物质，因此超滤时泡沫较丰富，初始物料溶液不易加入太多。待超滤开始一段时间后再补充多糖溶液，以防溶液溢出设备。

3.2 虎奶菇多糖的抗氧化活性分析

虎奶菇碱提和水提超滤多糖的超氧自由基和羟基清除活性如图1所示。超氧自由基的清除能力随着多糖浓度升高而升高，并且碱提虎奶菇粉末多糖的效果好于水提多糖，在5 mg/mL时，水提多糖的超氧自由基清除能力为58.5%，碱提多糖的清除能力为88.9%。

水提虎奶菇多糖在0.25mg/ml时羟基自由基的清除率最高，为65.6%；碱提虎奶菇多糖在0.125 mg/mL时清除率最高，为65.5%。但两种多糖的羟基自由基清除活性差别不大，且呈浓度下降趋势，有待于进一步的实验验证分析。

图1 虎奶菇水提和碱提多糖的超氧自由基和羟基自由基清除活性

4 结论

超滤技术是环境、食品等领域常见的一种工业化纯化分离工艺，但在天然活性多糖的分离纯化制备上应用不多。本文初步探究了卷式超滤膜用于分离纯化虎奶菇中提取的水溶性和碱溶性多糖，并对他们的抗氧化活性进行了比较，证明虎奶菇多糖是一种性能优良的天然抗氧化剂。

参考文献

[1]杨永彬,刘春辉,林远崇等.食药用真菌虎奶菇研究进展[J].中国食用菌,2007(03):3-5.

[2]曾小龙,胡高蒙.虎奶菇的化学成分与药理作用研究[J].中国食用菌,2007(05):3-7.

[3]王爽,王慧宾,韩晓丹等.虎奶菇水溶性粗多糖的制备及其红外光谱分析[J].化工管理,2019(33):168-169.

[4]蒋长兴. 青蛤多糖分离鉴定、硫酸酯化及其生物活性研究[D].南京农业大学,2011.

[5]肖娟,孙智达,谢笔钧等.荷叶生物碱的提取工艺优化及其清除羟基自由基能力的测定[J].食品工业科技,2009,30(07):194-197.