液相色谱-质谱联用技术在药物代谢研究中的重要应用

液相色谱-质谱联用技术在药物代谢研究中的重要应用

张健

江苏恒瑞医药股份有限公司 江苏 连云港 222000

摘要：经过20年的发展，液相色谱质谱（LC-MS）已经发展成一种自动化程度较高的常规检测方法，被越来越多的人所采用。多种软离子化技术，尤其是 ESP、 ISP和 APCI等多种软离子的应用，使得LC-MS在高极性成分的检测方面具有明显的优越性，可取代GC-MS，大大降低了样本（尤其是与其结合的代谢物）前处理的难度。对LC-MS存在的问题、仪器接口、离子化方法、流动相组成、 MS的发展以及在药物代谢产物的研究中的应用进行了简单的综述，着重阐述了其不同接口的构造及原理。

关键词：液相色谱质谱联用技术; 大气压离子化接口|离子化方法;药物代谢

一、概述

液相色谱~质谱(LC-MS)联用技术是 Horning在70年代开始对该技术进行开拓性的研究以来，它已经在20多年的时间里逐渐走向了成熟。各种化学设备不断出现，并且越来越多地被使用。（LC-MS）联用技术实际是以MS仪为检测手段的色谱技术，该技术集LC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体，已在药物代谢研究方面发挥了重要作用。

HPLC法能够分离到的化合物的范围要比 GC法更广得多。与GC-MS联用技术相比，LC-MS样品预处理非常简单，通常不需要水解或者衍生处理，因此可以对药物及其一相、二相等极性较大的代谢产物进行同时分离和鉴别。此外，HPLC法还为对药物及其一相、二相等极性较大的代谢产物的共价或者非共价结合的研究提供了方便、快捷和可行的手段。

二、LC-MS联用技术的发展

结合 LC与 MS这两种强大的检测手段，目前面临的问题是：（1）将1 mL.min-″的普通液晶柱的溢出液引入到需要高真空运行的质谱仪中，导致流速不可控。(2)LC在分离的过程中，由于常使用非挥发性添加剂，造成了溶液成分的不协调；（3）LC分析的非挥发性或热不稳定的试样进行电离。通过二十多年的研究，（1）和（3）问题已经逐渐被解决，（2）问题也有了一定的进展。

（一）液相色谱质谱联用技术的离子化方法

在目前仅有电离、化学电离和场解析三种电离方式的情况下，电离是LC-MS前期工作中重要的环节。液质联用技术不适用于LC-MS联用，EI-CI要求样品气态，但LC和LC-MS多以不易挥发的试样为主。因此，许多软离子化被开发出来，如：快速原子轰击，热喷雾，电喷雾，常压电离，以及 MALDI等，已基本解决了LC-MS的联用技术分析样品的离子化问题。

（二）液相色谱质谱联用仪的接口

研制出各种LC-MS接口，可以更好的解决LC流速与MS仪在真空条件下工作的匹配问题。目前已报道的LC-MS接口主要是模仿GC-MS仪器，而单纯依靠气相色谱柱的气相色谱柱，其使用范围受到了极大的制约。因此，我们提出了一种新的方法，如：直接流体导向（DLI)，粒子束（PB)，热等离子体（TSP)，连续流（或动态）快速原子轰击（CF-FAB）等，这些方法都具有很好的应用前景。然而，很多对LC-MSEI不敏感的物质都无法给出有效的结果，直到开发出 API界面后，LC-MS的应用领域才得到了进一步拓展。

MB是最早商业化的一种，它是一条连续传输的聚酰亚胺薄膜带， LC流出物通过该带从柱子两端输送到 MS仪的离子源，在此过程中，溶剂在真空下去除，样品挥发进入 MS。该界面的优势在于，在将试样放入离子源之前，所有的溶剂都已经被移除。然而，由于薄膜结构的不均匀，往往会造成溶液中的一些热不稳定物质在高温下发生溶解。其繁复的机构结构正逐步为 PB介面所取代，而目前微型化的使用则相对减少。

DLI通常是用4微米（id）的薄膜将液晶废水分成两半，将流分进人一个真空脱溶剂仓中，进行雾化和裂解，再进入连接在一起的 CI离子源中。其优势在于将一种易挥发、易失活的物质从液相转变为气相，通过流分的挥发，可以获得分子质量的数据，缺少结构的数据；但不足之处在于， DLI界面易受分离过程中的干扰，从而逐步被 TSP、 API等界面所取代。但是，随着高效液相色谱技术的不断发展，这种界面可以在不需要分离的情况下，直接将色谱分离出来的所有色谱分离液直接送入质谱。

LC流分经空气动力、热等方式进行雾化，液滴在脱溶腔内通过与液滴连接的两级动量分离装置产生的真空度对液滴进行加压，使液滴在脱溶腔内形成一个光束，并通过超声自喷射装置注入到脱溶腔内。在这种情况下，当质量更大、更大的样本颗粒被吸出后，通过传输管成一条细线，进入质谱离子源。组份颗粒碰撞到加热器内的壁面，使其汽化，电离，质谱；该界面的优势在于能够获得 EIMS，既能获得 EIMS的结构，又能在光谱数据库中查询，这在对未知样本的研究中具有非常重要的作用。

TSP界面同时具有两个作用：一是将液相液相流体送入质谱装置，二是去除溶剂，三是电离样本。试样以1 mL. min~1的速度经过一根电加热的不锈钢毛细管，在其对应位置放置一台机械真空泵，使包含细雾的蒸汽以超声速度喷出。在这种悬浮颗粒中，水滴有一些是带着电荷的。随着水珠穿过受热界面和离子源而持续地汽化。当电荷粒子尺寸变小时，其在液面上的电场会逐渐增强，直至电荷粒子脱离液滴，并通过一个圆锥采样孔流入质谱。加入乙酸铵等挥发性酸、碱和盐类，有利于样品中的离子生成。

（三）流动相组分的谐调

在所有的LC-MS接口技术中，都不允许加入磷酸根缓冲液、离子对试剂等不挥发性成分。Henion等8）报告了 APCI利用了逆流干燥气体技术，它能够将非离子（或不）挥发性物质从毛细管的喷嘴中清除到大气中。储存舱中，在不需要移动真空系统的情况下，可以很容易地除去储存舱中的非挥发性污物，同时还可以使用挥发和非挥发性缓冲液。在对流动相进行选择时，要尽量避开不容易产生挥发性成分，尽量选用容易产生挥发性成分的缓冲剂。这是从质谱分析的观点来看，有时候液相色谱很困难。为了达到这个目的，人们做了很多的探索工作，如 Barcel等人采用了联机连续流动的液体提取方法；Kokkonen等人利用了两个圆柱的技术，并将其简化成了阀门变换技术；Hsu'l2采用了一种新的在离子交换层析中进行电导率测定的技术——微型薄膜抑制剂法，采用了 TSP和 PB两种离子交换液质联用技术，并将其应用于离子对液质联用中。该研究在一定程度上解决了在液质联用中添加不易挥发性组分的难题，拓宽了液质联用技术的适用领域。

三、LC-MS用于药物代谢的分析

质谱技术已成为一种有效的方法，用于研究合成药、天然药及转化产物在生物体中的代谢及生物降解过程。高分子量的药物、生物合成的药物、天然多肽、 DNA重组技术合成的蛋白质、结合代谢产物等均不适合色谱-质谱联用。首先是适合于中极性物质测定的 TSP；随后，发展出性能更加优异的 ESP、 ISP、 APCI等技术，逐渐替代 TSP，实现了中高极性成分的快速检测，并在不需要繁琐的样本前处理的情况下，被广泛应用于多种物质的人体及动物的代谢过程，在大、小分子的药代动力学研究方面具有重要意义。

四、小结

总之，LC-MS在药物代谢方面有着其它方法无法相比的优势，但也存在着一些不足，例如：（1）在 ESP或 APCI中，使用加热器时，如果加热器的温度太高，则会导致非常不稳定的物质发生热分解；(2)如果在流动相中添加三氟乙酸等修饰剂，例如三氟乙酸，将与试样发生电离作用，因此，在对蛋白、多肽进行实际的分离时，需要添加微量三氟乙酸；(3)如果在流动相中水分含量太高，或者在水中溶解度太高，都会出现表面张力，造成感光性能下降，通常采用专门的设备加入保护剂来处理；(4)质谱响应数值受物质种类、流相成分等因素影响很大，（5）随着流体速度的增大，测定的敏感性逐渐下降，其中以 ESP、 ISP最为明显，因此，微量高效液质联用技术的发展将逐步推进液质联用技术的发展。

参考文献：

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[3]胡丽娟.高效液相色谱一质谱联用技术在药物分析中的应用[J].中文科技期刊数据库(引文版)医药卫生,2022(1):4.