HPLC法测定益气健脾口服液中枸橼酸的含量

HPLC法测定益气健脾口服液中枸橼酸的含量

莫小丹1肖德冰 2 罗开琼1

1 湛江市食品药品检验所524000；2 嘉应学院医学院

摘要：目的：建立益气健脾口服液中枸橼酸含量测定的方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为中谱红ODS-H(250×4.6 mm,5 μm)，流动相为0.1%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH至2.8)，流速为0.7 ml/min，采用等度洗脱，柱温为28℃，检测波长为210 nm，进样量为10 μl，进行含量测定。结果：枸橼酸的理论塔板数大于7000，峰面积的RSD为1.9，小于2.0%；枸橼酸浓度在25.31~126.5 μg/mL(R2=0.9992)范围内线性关系良好：重复性，色谱条件耐用性的RSD%均小于2.0；平均加样回收率为100.7%，RSD%为1.6；精密度的RSD%为0.4，表明精密度良好。结论：该方法高效简便，准确性、重复性好，耐用性强，可为该款益气健脾口服液对枸橼酸质量控制的提供科学依据，更科学评价和有效控制益气健脾口服液中枸橼酸含量。

关键词：益气健脾口服液；含量测定；枸橼酸；高效液相色谱法

益气健脾口服为中药成方制剂，其质量标准收载于国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS-5257(B-0257)-2014Z及国家药品监督管理局药品补充申请批件2019B02293。处方是由太子参，山药，桑叶，莲子，绿豆，乌梅，白扁豆，黑豆，南山楂，稻芽，鸡内金以上十一味中药经过煎煮提取加工而成的中成药口服液体制剂，辅料为蔗糖。药方中的药材均为药食同源，药性温和，安全性高，可长期服用，组方还兼具着健脾，益气，消食三大功效，遵循君臣佐使。山药可健脾益胃，免疫调节[1]，药力为方中之首，为君药；太子参增强益气健脾、生津润肺[2]之功，故太子参为臣药；佐以绿豆、南山楂合用，既能改善脾虚湿盛导致的口淡不渴，食少乏力，也可清热解毒，调和五脏，避免诸邪反复蕴结于内[3]，协助山药、太子参治疗兼症；使以桑叶疏散风热，清肺润燥，乌梅消食去滞，涩肠止泻，运脾化湿[4]抗氧化，降血脂[5]，莲子，白扁豆，黑豆清心醒脾，健脾利湿，稻芽消食和中，健脾开胃，鸡内金理气利湿，健胃消食[3]，为药方引经调和。在日常生活中，能有效治疗由脾胃虚弱引起的不思饮食，食后腹胀，神疲乏力，面色不华，大便不调，脾虚疳积，消化不良等。在临床上，多用于儿童消化不良或作为脾胃虚弱的辅佐治疗, 改善食欲不振、四肢乏力、盗汗、腹胀、腹痛、畏寒等症状[6]，常与化药联合治疗肠胃疾病，减缓不良反应。如叶康靖[3]等在治疗婴幼儿非急性湿疹时，祛湿止痒膏联合益气健脾口服液治疗，避免邪气反复侵袭，久滞肌理，达到内外兼治，不良反应少，复发率低；如何翠婷[7]等应用益气健脾口服液与双岐三联活菌胶囊联合治疗，患儿腹痛，腹泻症状缓解，治疗时长得以明显缩短，且取得更好的疗效。

1 仪器与试药

1.1仪器

岛津高效液相色谱仪（型号：LC-20A），HA125SM型电子天平 (德国普利赛斯公司)，SK8200HP型超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2试药

益气健脾口服液（广州一品红制药有限公司，批号为10221040），枸橼酸对照品（批号为100396-201302，购自中国食品药品检定研究院），流动相用甲醇、乙腈为色谱醇，水为超纯水，其他为试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：中谱红ODS-H柱(250×4.6 mm,5 μm);流动相：0.1%磷酸二氢铵(用磷酸调节pH至2.8);流速：0.7 mL/min;等度洗脱;柱温：28℃;检测波长：210 nm;进样量：10 μl。

2.2对照品溶液的制备

精密称取枸橼酸对照品0.01012 g至20 ml容量瓶，用水溶解并定容，作为对照品储备液，精密量取1 ml至10 ml容量瓶中 ，用水定容，摇匀，过0.45 μm的滤膜，即得浓度约为50.0 μg /ml的对照品溶液。

2.3供试品溶液制备

     精密量取益气健脾口服液1 ml放置于100 ml容量瓶中，用水稀释，摇匀定容，过0.45 μm的滤膜，即得。

2.4方法学考察

2.4.1系统适应性试验

按照2.2项下方法制备对照品溶液，精密吸取对照品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪中，重复进样6次，计算峰面积RSD%。结果表明，枸橼酸的理论塔板数大于7000，峰面积RSD%为0.4，本法的系统适应性结果良好。

2.4.2线性范围试验

从2. 2项的对照品溶液中，分别精密移取0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml，制备浓度分别为25.3 μg/ml、50.6 μg/ml、75.9 μg/ml、101.2 μg/ml、126.5 μg/ml的线性对照品溶液，各取10 μl注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值(μg)为横坐标，进样浓度(μg/ml)为纵坐标，绘制枸橼酸标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果表明，以峰面积为纵坐标，枸橼酸浓度为横坐标作图，得到方程y=969.17x-200.4，R

2=0.9998，枸橼酸对照品在25.3~126.5 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4.3重复性试验

分别精密量取同批益气健脾口服液样品6份，按2.3项分别制成供试品溶液，按照拟定色谱条件进行测定含量，以外标法计算供试品中枸橼酸的含量，计算样品的RSD值。    

结果表明，6份供试品的RSD%为1.4，重复性结果良好。

2.4.4加样回收试验

    取已知含量的同批供试品按上述2.3项的方法制备供试品溶液，配置成浓度梯度为50%，100%，150%。精密量取3.80 ml供试品溶液于10 ml容量瓶中，各浓度梯度3份。从上述 2.2项中的对照品储备液中吸取不同含量的对照品溶液添加到上述的供试品溶液中，摇匀，过滤，注入高效液相色谱仪，测定含量，分析色谱图，计算不同加标量的加标回收率。

表1 枸橼酸含量测定准确度结果

结果表明，高、中、低三个浓度的回收率及9个样品的平均回收率均90.0%~108.0%范围，RSD%小于2.0，因此本法回收率良好。

2.4.5稳定性试验

取供试品溶液、对照品溶液分别于室温下放置0、1、2、5、7 h取样，分别进样10 µl，

记录色谱峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD%)。结果表明，RSD%为0.50，供试品溶液在室温放置情况下7 h内稳定性良好。

2.4.6色谱条件耐用性试验

    按表9所列的色谱系统参数变动，对色谱系统参数(如流速、柱温、检测波长、pH)进

行调整后，取供试品溶液及对照品溶液分别测定，记录色谱图，计算枸橼酸含量、相对偏

差，考察色谱条件变动对检测结果的影响。结果表明，在柱温(28℃±1℃)；流速(0.7 ml/min±0.1 ml/min)；波长(210nm±1 nm)；pH(2.8±0.1)下，变动条件与拟定标准条件相比，相对偏差最大值为2.7%，小于3.0%，该色谱条件耐用性良好。

2.5样品含量测定

分别取批号为10221040、10221064的益气健脾口服液按照2.3项制备供试品溶液，分别进样10 μl，依照2.4.2项下所得的标准曲线方程计算其中枸橼酸的含量和每个批号该含量的相对标准偏差(RSD%)。结果表明，批号为10221040的益气健脾口服液中枸橼酸的含量为9.64 mg/ml，RSD%为1.1；批号为10221064的益气健脾口服液中枸橼酸的含量为9.84 mg/ml，RSD%为1.5。

3 讨论

3.1色谱条件的选择

为了在适宜的时间分离出目标成分，参考相关文献[14,15]，考虑在以下四种流动相中筛选，甲醇:0.1%磷酸溶液(1:9)；乙腈:0.5%磷酸二氢铵pH3.0(3:97)；0.5%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH至2.8)；0.1%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH至2.8)。在含有乙腈和甲醇的流动相中，即使对其中有机相的配比微调，降低比重，均未得到良好的分离，且出峰时间在2 min到6 min，出峰时间较早，受溶剂峰影响大；在不含有机相的缓冲盐流动相中，成分得到了很好的分离，且出峰时间适宜，由于枸橼酸在水溶液中容易解离，产生多峰现象，因此在流动相中加入酸抑制剂调节pH来降低枸橼酸的解离[16]，以缓冲液作为流动相，利于流动相pH值的稳定，改善峰形，提高样品的重复性，且磷酸盐缓冲液在紫外区几乎无吸收[13]，所以选用低浓度的0.1%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH至2.8)作为流动相。实验还对流动相的不同流速进行考察，流速分别为0.5，0.7，1.0 ml/min，流速为0.7 ml/min时，出峰时间适宜，且主峰理论塔板数最高，分离度和拖尾因子均符合要求，因此确定流速为0.7 ml/min。

对酸性化合物的测定，流动相的pH选择尤为重要，尽量使其以分子形式存在色谱柱上得到分离，了解分析物的 pKa值才能有效地选择流动相 pH 值[17]。按表13，枸橼酸电离后主要存在形式和pH有关，供试品的pH范围在2.7到2.9之间，所以选择流动相的pH值为2.8。

枸橼酸的极性较大，易溶于水，制备时首先参考了《中国药典》2020版一部中山楂和乌梅药材中对枸橼酸含量测定的提取溶剂，确定以水作为溶剂即可，提取效率高，方法简便。

3.2检测波长的选择

对枸橼酸的对照品溶液在190～800nm波长范围进行全波长扫描，结果表明在210nm波长处有最大吸收。[18,19]

3.3专属性试验的结果分析

A

B

C

A：供试品溶液；B：阴性样品溶液；C：对照品溶液

图2 枸橼酸色谱图

Fig.2 Chromatogram of Citric Acid

结果显示，A图中供试品的枸橼酸目标峰的保留时间是10.163min，C图中对照品的枸橼酸目标峰的保留时间是10.166min，保留时间基本一致，即供试品和对照品目标峰一致，缺山楂、乌梅和桑叶的阴性样品在相应的枸橼酸峰位置处可能存在干扰峰，分离度为1.416小于1.5。由于实验条件限制，不能完全复刻制备工艺，导致提取杂质较多，分离度差；且枸橼酸在大多数中药中普遍存在的这种情况下[20]，难以完全筛除出含有枸橼酸的药材，导致阴性制剂配置失败，无法验证该方法专属性。

   结论

本实验建立高效液相色谱法测定益气健口服液中枸橼酸的含量，色谱柱为中谱红 C18(150×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.1%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH至2.8)，等度洗脱，柱温为28℃，检测波长为210 nm。该方法下，枸橼酸理论塔板数大于7000，且峰面积的RSD%<1.0；在25.3～126.5 μg/mL(R2=0.9998)浓度范围内线性关系良好；重复性、溶液稳定性小于2.0，色谱条件耐用性RSD%小于3.0；平均加样回收率在90.0%～108.0%，RSD%均小于2.0。该方法简便、准确、重复性好，分析速度快，样品前处理简单，供试品取样量小，溶剂为水，流动相无有机溶剂，安全性高，为科学评价和准确测定益气健脾口服液中枸橼酸含量提供依据。

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