孕妇清火丸质量标准研究

孕妇清火丸质量标准研究

杨兰春

重庆市黔江食品药品检验所，重庆 黔江 409013

摘要：目的:建立孕妇清火丸制剂中白芍药味含量测定。方法：高效液相色谱法；色谱柱：Inertsustain（4.6mm×250mm,5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15:85）；检测波长230nm ；流速1.0mL/min；柱温25℃。结论：本方法简便快捷、专属性强，该法中芍药苷在1.7925～1.8137mg (r=1  ,n=6)范围内进样量与对应的峰面积呈良好的线性关系，平均回收率可达(n=6) 97.28%，RSD=1.17%，初步确定孕妇清火丸制剂中芍药苷的量不得少1.80mg/g。

关键词：孕妇清火丸；高效液相色谱法；芍药苷；白芍

孕妇清火丸现收载于《中华人民国共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第一册（WS3-B-0061-89），仅收载了处方、制法、性状及显微鉴别等项目，无控制其内在质量的标准。目前全国有2家生产企业生产销售该制剂，一是商丘市金马药业有限公司（批准文号为国药准字Z4102160 4）,二是北京同仁堂制药有限公司（其批准文号是国药准字Z11020671）。为了更有效地控制该制剂质量和提高制剂使用的安全性，本次实验运用高效液相色谱法对制剂中白芍药味进行含量测定，为临床安全用药提供保障。孕妇清火丸由黄芩、知母、石斛、柴胡、地黄、薄荷、白芍、白术（麸炒）、甘草等九味药物组成，为黄褐色水丸，具有清火安胎的功效。处方中白芍温阳祛湿、补体虚、健脾胃。本制剂针对孕妇胎热有良好的疗效，具有较高的临床价值。

1 仪器与材料、试剂、试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器，SDP-20A  岛津）,电子分析天平（XPE205十万分之一；XPE204电子天平;梅特勒托利多），超声波提取仪（SB-800DT，青岛海洋化工有限公司），密理博（超）纯水机（Milli Direct-Q16，美国）；

1.2 试剂

乙腈、磷酸、95%乙醇（重庆万盛川东化工有限公司）；水为超纯水

1.3 试药

芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院110736-201842）；孕妇清火丸（19081030,、19081035、19081034北京同仁堂制药有限公司）

2 色谱条件考察

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertsustainC18(4.6mm×250mm,5μm)；柱温:25℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(15:85)[1-4]；检测波长:230nm；流速:1.0ml/min,进样量10ul。

3 各种溶液的制备

3.1 供试品溶液的制备

取孕妇清火丸样品18g，粉碎，过3号筛。精密称取1.0g，置于具塞锥形瓶中，密塞，精密量取已经配制好的稀乙醇溶液50mL，用十万分之一的天平称定重量，超声处理60分钟（功率250W,频率33KHZ），然后放冷至室温，再次称定重量，若重量有变化就用稀乙醇补足减失的重量，然后摇匀，再用化学分析纸张和漏斗滤过，弃去前段溶液，取中间段的续滤液，然后用0.22um的微孔滤膜滤过，即得。 

3.2 对照品溶液的制备

精密称取(所内编号为2021BY0172)的芍药苷对照品，加前述已经配置好的稀乙醇[5]制成每1mL含0.5mg的芍药苷对照品母液(所内编号为2021BY0172-1),摇匀，即得。

3.3 阴性对照样品溶液的制备

按照孕妇清火丸成药制剂处方除掉芍药药味，同时依照其处方比例，取阴性样品0.2g，然后按照上述供试品溶液的制备方法进行制备，得到阴性样品溶液。

4 检测波长的确定

通过试验发现白芍与芍药苷对照品经DAD检测器进行紫外吸收光谱扫描，二者均在230nm处有最大吸收，故检测波长就确定为230nm。

5方法学验证

（1）专属性试验

分别吸取3.2项下对照品溶液、3.1供试品溶液及3.3阴性样品溶液各10μL，依次注入高效液相色谱仪，上机测定，即得。

在上述2色谱条件下，芍药苷对照品峰与供试品峰保留时间相同，供试品溶液中芍药苷峰与供试品中其它组分色谱峰可达基线分离，且与其它相邻色谱峰分离度大于1.5，以及芍药苷峰的理论塔板数不得低于8000。同时对3.3阴性样品溶液进样测定时，在芍药苷峰位置处无吸收峰，即阴性无干扰。对照品、供试品、阴性样品溶液色谱峰分别见图1、图2、图3。

图1 芍药苷对照品色谱图

第1页（共30页）

图2  孕妇清火丸供试品色谱图

图3 孕妇清火丸阴性色谱图

（2）标准曲线与线性范围考察

分别精密量取芍药苷对照品母液（浓度为0.508915mg/mL）1mL定容至50mL的具塞无色玻璃容量瓶中、精密吸取2mL母液用稀乙醇溶液定容至50mL、2mL定容至25mL、3mL定容至25mL、4mL定容至25mL，之后分别吸取上述5种不同浓度的溶液各10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件上机进行分析，测得峰面积结果表明，芍药苷含量在0.01018～0.08143mg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y = 1E+07x –6215.8，r=1。如图4、表1所示。

表1芍药苷对照品线性测定结果表

                      图4芍药苷对照品线性测定图

（3）仪器精密度试验

精密吸取对照品溶液（0.508915mg/mL）10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析，平行测定6次，并记录其峰面积，结果见表2：

表2 精密度试验结果

上图显示，仪器具有良好的精密度。

（4）重复性试验

取批号为19081035的样品共6份，按前述提取方法制成供试品溶液，分别精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，通过计算结果计算RSD值。结果见表3。

表3 方法重复性试验结果

如表3所示，样品含量平均值为1.8049ug/ml，相对标准偏差为0.23%，表明本含量测定方法具有良好的重复性。

（5）稳定性试验

1.对照品溶液稳定性试验结果

在常温条件下，取同一对照品溶液，在不改变其他参数的条件下，改变其时间参数（0h、2h、4h、6h、8h）进样取样，每次10μL，测定并记录其色谱峰面积，同时根据结果计算RSD，结果见表4。

表4对照品溶液稳定性试验结果

如表4所示，供试品溶液相对标准偏差为0.7% ,表明供试品溶液在8小时内是趋于稳定的。

2.供试品溶液稳定性试验结果

在常温条件下，取同一供试品溶液，在不改变其他参数条件下，改变其时间参数（0、2、4、6、8）小时进样取样，每次10μL，测定并记录其色谱峰面积，同时根据结果计算RSD，结果见表5。

表5 供试品溶液稳定性试验结果

（6）加样回收率试验

精密称取已知含量（芍药苷含量为1.8017mg/g）的样品（批号：19081035）6份，分别精密加入浓度为508.915μg/mL的芍药苷对照品母液溶液1mL，芍药苷加入量为0.001045mg，按供试品溶液的制备样品分别进样10μL，按样品测定方法测定其含量，按下述计算式计算回收率，结果见表6。

表6  芍药苷加样回收试验结果

回收率试验结果表明，6次试验的加样回收率测得结果均在90%～99% 之间，相对标准偏差为1.17%，说明该方法的回收率良好。

5.1样品含量测定

取3（批号19081030、19081035、19081034）批不同生产批号的样品，每批取2份，按供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取对照品溶液10μL，样品各10μL，按前述色谱条件测定，记录色谱图，计算其含量，结果见表7。

表7  样品含量测定结果

5.2 检测限

将芍药苷对照品溶液稀释，精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析，测得其信噪比。最终得出检测限为10ng。

5.3 小结与结论

本试验最终确定色谱条件为色谱柱：InertsustainC18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(15:85)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：230nm。

对三批孕妇清火丸制剂中的芍药进行含量测定，试验结果每克含芍药苷1.7925～1.8137mg，暂定制剂中含芍药以芍药苷计，不得低于1.80mg/g，即不少于10.8mg/瓶。

在含量测定研究中，确定了以白芍中芍药苷作为含量测定指标。在供试品溶液的制备中，参考了《中国药典》（2020年版）[5]一部白芍药材标准项下含量测定方法。流动相经多次试验，最终选定以乙腈-0.1%磷酸溶液（15:85）为流动相，发现分离度效果良好，保留时间适宜，基线平稳，理论塔板数达到要求。

综上所述，在孕妇清火丸现有的质量标准基础上，本研究增加对白芍药味的含量测定，进一步完善了孕妇清火丸的相关质量控制标准。不足之处在于，该处方制剂成分复杂，只讨论单个药味的标准研究往往不能完全保证该制剂用药安全，所以多种药味都应建立其相应的质量标准。

参考文献：

[1]高效液相色谱法测定白芍药材中白芍总苷含量，刘敏颜，高秀强，王永等，中国药业，2008第五期：（22-23）

[2] HPLC法测定马氏接骨丸中白芍苷的含量，王旭天津市北辰中医医院制剂室

内蒙古中医药2014年 第5期：（52-52）

[3]HPLC法同时测定白芍中芍药苷、芍药苷亚硫酸酯成分含量，于定荣，谷巍等，中国中医科学院中药研究所等，海峡药学2021年5月

[4] HPLC法测定健胃胶囊中芍药苷含量，赵南、肖锦新等，贵州百灵企业集团制药股份有限公司，海峡药学2019年8月

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2020

第1页（共30页）