长双歧杆菌BL21包埋微珠体外耐受及[l1]在低温酸奶应用研究

 长双歧杆菌BL21包埋微珠体外耐受及[l1]在低温酸奶应用研究

柯百胜1,2，黄维佳1,2，金阳1,2，林单1,2，康婉莹1,2，刘峰1,2,3

（1.广东省肠道微生态企业重点实验室，深圳　518107；2.深圳万和制药有限公司，深圳　518107；3.南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌　330031）

摘　要对长双歧杆菌BL21菌粉和包埋后微珠[l2]进行体外模拟胃肠耐受实验并考察它们分别与低温酸奶混合后的性质变化的结果表明，包埋后BL21微珠对模拟胃肠液耐受力显著提高，且对低温酸奶品质无明显相互影响。微珠与菌粉相比，经pH1.2人工胃液3.0h后BL21活菌数提高5×108倍，经人工小肠液（0.3%胆盐）4.0h后活菌数提高107倍；添加菌粉酸奶对酸奶品质影响较大，双歧杆菌活菌数货架期内无法保持稳定，而添加BL21微珠酸奶货架期内pH值、酸度与空白酸奶无明显差异。添加BL21包埋微珠酸奶在保持酸奶原有风味并提高咀嚼感[l3]的同时，保证货架期内活双歧杆菌数量的相对稳定。

关键词  包埋、长双歧杆菌BL21、微珠、体外耐受

Study on in Vitro Tolerance of Bifidobacterium Longum BL21 Embedded Microbeads and its Application in Low Temperature Yogurt

KE Bai Sheng1,2，Huang Wei Jia1,2，JIN Yang1,2，LIN Dan1,2，KANG Wan Ying1,2，LIU Feng1,2,3

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Microecological Preparations,Shenzhen 518107；2.Shenzhen Wanhe Pharmaceutical Co., LTD,Shenzhen 518107；3.School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University,Nanchang 330031,China)

AbstractThe results of in vitro simulated gastrointestinal tolerance experiment of bifidobacterium longum BL21 powder and microbeads,as well as the property changes after mixing with low-temperature yogurt, showed that the tolerance of BL21 to simulated gastroenteric fluid was significantly improved after embedding, and microbeads had no obvious influence on the quality of low-temperature yogurt. Compared with bacteria powder, the viable bacteria count of BL21 increased by 5×108 times after pH1.2 artificial gastric juice for 3.0h, and 107 times after 4.0h after artificial intestinal juice (0.3% bile salt). The addition of bacterial powder yogurt had a great impact on the quality of yogurt, and the number of viable bacteria of bifidobacterium could not remain stable during the shelf life, while the acidition of BL21 microbeads yogurt were not significantly different from blank yogurt.The yogurt can maintain the original flavor of yogurt and increase the chewability, while ensuring the relative stability of the number of live bifidobacterium during the shelf life.

Key wordsembedding;bifidobacterium longum BL21;microbead;tolerance in vitro

近年，对益生菌功能研究日益增多增广，益生菌产生多种代谢产物可有效调节肠道微生态平衡治疗和预防多种疾病[1-5]。本研究采用的长双歧杆菌BL21对于降低血脂、预防直肠癌发生有一定作用[6,7]。益生菌作用的部位主要集中在肠道，只有通过胃酸、肠道胆汁盐、消化酶等体内环境的重重考验才能真正发挥有效作用[8]。如何提高益生菌胃肠耐受是亟需解决的热点问题，通过防酸防水材料物理包埋提高耐受性成为可行方案之一[9-11]。本研究对比BL21菌粉和微珠胃肠体外模拟耐受性，并考察菌粉和包埋微珠对低温酸奶品质的影响。[l4]

1材料与方法

1.1 材料与试剂

长双歧杆菌BL21（江苏微康生物有限公司）；BL21微珠（广东省肠道微生态重点实验室自制）；低温酸奶（市售）；MRS培养基、牛胆盐（广州环凯微生物科技有限公司）；胃蛋白酶（≥1∶2500）、胰蛋白酶 （≥50 000 U/g，1∶250，BR）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾（国药集团化学试剂有限公司）。

基金项目：广东省肠道微生态制剂企业重点实验室(2022B1212020004)；深圳市新型口服固体制剂工程研究中心组建项目(XMHT20220104010)。

作者简介：柯百胜（1983-）,男，硕士，研究方向功能食品开发。

通讯作者：刘峰

1.2仪器与设备

SW-CJ-2F超净工作台（苏州净化工作台设备有限公司）；SN310C高压灭菌锅（重庆雅马拓科技有限公司）；Bactron EZ-2[l5]厌氧培养箱（美国Shellab[l6]公司）；T25均质机（艾卡广州仪器设备有限公司）；pH计FE28（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；超纯水机type1（美国密理博有限公司）；质构仪CT3（博勒飞仪器有限公司）；电热恒温箱DF411C（重庆雅马拓科技有限公司）；溶出仪1206（[l7]深圳市华溶分析仪器有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1微珠大小、强度及水分含量测定

大小：随机取微珠20颗，用游标卡尺测量其直径，求平均值。

硬度：将微珠放置在质构仪测试台中，使用A/BE探头，直径=40mm，探头移动速度=0.5mm/s，出发力=4.0g，随机测定10颗微珠硬度，求平均值。

水分含量：取5g微珠置于105℃烘箱烘至恒重并记录。水分含量计算公式为：

水分含量=

式中：M1为干燥前质量；M2为干燥后质量。

1.3.2 活菌数测定

BL21微珠：无菌操作筛分称取1g益生菌微珠，置于装有99 mL生理盐水的无菌三角瓶，18000 r/min 均质 4min，制成 1:100 样品匀液。样品使用生理盐水梯度稀释。计数方法参照《GB 4789.35 食品安全国家标准 食品微生物检验 乳酸菌检验》检测活菌数。

BL21菌粉：参照《GB 4789.35 食品安全国家标准 食品微生物检验 乳酸菌检验》检测活菌数。

1.3.3　BL21菌粉存活率

通过比较BL21微珠和BL21菌粉在模拟胃肠液中存活率，评估包埋处理菌株对胃肠道环境的耐受效果，存活率比值计算：

存活率比值=

式中：Z1为BL21微珠经消化后活菌数，Z0为BL21微珠初始活菌数；F1为BL21菌粉消化后活菌数，F0为BL21菌粉初始活菌数。

1.3.4 模拟胃肠液消化

参考《中国药典》配置pH1.2人工胃液[12]；采用溶出仪篮法测定不同时间点微珠活菌数。取BL21包埋微珠1克，分别放入取样篮内，分别经过1.0、2.0、3.0h后测定篮内物活菌数，每组4个平行。参照《中国药典》配置人工小肠液[12]并添加3%的牛胆盐，将经过人工胃液2小时后样品，再换至人工小肠液中4小时测定活菌存活率。溶出仪测试条件为37℃，100r/min。

另外，参照《中国药典》配置人工结肠液（ pH7.8磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水溶成1000mL)，将经过小肠液的微珠转移至人工结肠液2h，测定溶出液中活菌数折算成每克微珠的活菌数。

1.3.5 货架期内BL21微珠低温酸奶性质变化情况

以市售原味酸奶作为空白对照，将添加质量1%BL21微珠及相同活菌数未经包埋的BL21菌粉作为阳性对照低温酸奶放至蓝盖瓶中，搅拌均匀封口膜密封，5℃保藏。分别监测空白对照组酸奶、BL21菌粉酸奶、BL21微珠酸奶28天内pH、酸度、活菌数及末期感官性质。由深圳市万和制药有限公司研发人员和营销人员共30人参与感官评价[13]，评价标准如表1所示。

表1 　酸奶感官评价评分标准

2. 结果与分析
   1. BL21微珠物理特性

将BL21菌粉分散在油脂层作为内层，中层加入高熔点油脂，次外层为食品级凝胶剂，最外层为防水防酸包衣层制成BL21微珠，图1为微珠剖面与形态示意图。

　　　　图1 微珠形态与剖面示意图

BL21微珠直径、硬度、含水量、水活测定结果如表2所示

表2BL21微珠的基本物理特性

2.2BL21菌粉与微球在人工胃肠液的耐受性[l8]

2.2.1人工胃液的耐受

胃液是人类免疫屏障，对微生物具有强的杀灭作用，且无识别性。益生菌需要通过胃酸的考验活着到达肠道内才能发挥益生作用。本研究制备的BL21微珠在人工胃液中不溶解、不破裂，从而保证顺利到达肠道释放BL21长双歧杆菌。BL21微珠在不同pH值的人工胃液中消化1.0、2.0、3.0h[13]的活菌数如图2所示。

LB21菌粉和微珠经过pH值1.2的人工胃液消化3h后，菌粉活菌数显著下降，下降约8个数量级；而微珠未见数量级下降，约下降30%；微珠活菌数是菌粉活菌数的5×108倍。由此可见微珠包埋明显提高长双歧杆菌BL21的胃酸耐受性，另外人工胃液3h微珠状态仅仅变软未见有明显破损或变形，整体包裹完整。

2.2.2 人工小肠液的耐受

食物经过胃液消化后进入十二脂肠与具有抑菌作用的胆盐接触，胆盐会破坏细胞膜造成细菌死亡，因此需要评估益生菌对胆盐耐受能力。分别将BL21微珠和菌粉在人工小肠液添加质量分数为0.3%胆盐溶液中消化1、2、3、4h[15]后测定溶出篮中微珠的活菌数如图3所示。

由图3可知，BL21微珠经人工小肠液（添加0.3%胆盐）消化后，微珠表面包衣层逐渐消失溶解。随着时间的延长活菌数逐渐降低，部分小肠液缓慢渗透入脂肪层使内层菌粉失活。4小时后活菌数下降约为65%，未见数量级下降。而重新投入开始相同活菌数的BL21菌粉在经过人工小肠液3h后，活菌数下降明显，整体趋势与人工胃液相同。显而易见，微珠相比于菌粉，耐受性改善明显，显著提高活菌到肠率。

2.2.3 人工结肠液的释放

将经过人工胃液、人工小肠液消化后的微珠投入到人工结肠液中，同样采用100r/min，37℃

溶出仪篮法进行测定活菌数如图4所示。

由图4可知，人工结肠液1h后微珠溶解消化加快，内层菌粉层快速释放，溶出液活菌数增加；2h后微珠溶解消化消失内层菌粉完全释放达到最大值；3h，4h溶出液活菌数有略微下降，可能由于长双歧杆菌BL21激活后缺失营养而失活所致。

2.3BL21微珠在低温酸奶中的应用

《GB 19302 食品安全国家标准　发酵乳》规定，低温酸奶应在21天保质期内风味、质构等感官特性应无显著变化。添加益生菌低温酸奶货架期内容易出现后酸化现象，在低温条件下益生菌会保持代谢状态，继续产生乳酸、乙酸等有机酸，可能会对发酵乳的风味产生影响。因此对于添加BL21微珠的酸奶的pH值、酸度、活菌数和感官指标进行测评。

2.3.1货架期内酸奶pH值和酸度变化

为了验证BL21微珠与酸奶混合后是否会影响低温酸奶保质期内的品质，检测了添加微珠酸奶、添加BL21菌粉酸奶及原味空白酸奶保质期内pH值和酸度，结果如图5和图6所示。

由图5和图6可知，空白酸奶保质期21d，pH值从4.6下降至4.1，酸度从88.0°上升至93.0°；添加BL21菌粉酸奶pH值从4.6下降至3.6，酸度从88°上升至116°；添加BL21微珠酸奶pH值从4.6下降至4.0，酸度从88°上升至94°。添加菌粉酸奶pH值下降幅度略大；酸度上升明显；添加微珠酸奶和空白酸奶pH值与酸度变化基本相同无显著差异。

2.3.2酸奶和微珠中活菌数变化

为了进一步证实BL21长双歧杆菌菌粉及微珠菌株在酸奶体系下的代谢情况，分别测定添加BL21菌粉酸奶和BL21微珠酸奶中双歧杆菌的活菌数，结果如图7、8所示。[l9]

由图7可知，添加2.05×108cfu/g BL21菌粉的酸奶中双歧杆菌活菌数随着时间极具下降，保质期后双歧活菌数下降至104cfu/g，下降4~5个数量级。由此可见，添加长双歧BL21菌粉酸奶无法保证长双歧杆菌BL21活菌数相对稳定。[l10]而由图8可知，添加2.13×108cfu/g BL21微珠酸奶珠内长双歧杆菌BL21活菌数保质期后下降约30%，仍然具有较高的活菌数量达到1.65×108cfu/g，未见数量级下降。

2.3.3酸奶感官评价

　　添加菌粉、添加微珠和空白酸奶的感官评价结果如图9所示。

　　由图9可知，添加BL21微珠和空白酸奶气味、口感、滋味、组织形态无明显差异，咀嚼感有一定提升，整体喜好度基本一致；添加BL21菌粉酸奶口感、滋味较差，其他与原味酸奶无显著差异。

3. 研究结论与展望

通过对长双歧杆菌BL21包埋前后的体外耐受性对比研究发现：经过人工胃液3.0h后，菌粉活菌数包埋微珠是菌粉的5×10

8倍；菌粉经人工小肠液（0.3%胆盐）3h，包埋微珠经过胃液3h再经过人工肠液4h后，微珠的活菌数仍是菌粉的约107倍。微珠在人工结肠液中能较快的溶出，释放内层活菌。

通过测试添加长双歧杆菌BL21菌粉和包埋微珠的酸奶的保质期内pH值、酸度、双歧杆菌BL21活菌数及感官评价可知，添加BL21菌粉对低温酸奶的pH值、酸度、口感、滋味影响较为显著；添加BL21微珠对低温酸奶pH值和酸度影响较小，对酸奶除咀嚼性指标以外感官指标影响不明显且可明显提高咀嚼性。与此同时，包埋微珠可保护长双歧杆菌BL21在货架期内保持较高数量的活双歧杆菌。目前低温酸奶市场缺少双歧杆菌酸奶且保持双歧杆菌活菌数稳定的产品，该研究制备的微珠酸奶对市场起到有效补充，更有益人类健康。与此同时，微珠包埋工艺可对各种耐受性差、不稳定的功能菌珠进行有效包埋扩大应用范围。

参考文献：

[1]黄佳豪,李先平,赵军英,乔为仓,刘璐,陈历俊.益生菌缓解高尿酸血症作用机制研究进展[J].食品科学:1-22.

[2]邵亮,陈晓敏,徐广顺,万丽.益生菌治疗功能性便秘疗效及其对肠黏膜脑肠肽的影响[J].山西医药杂志,2023,52(01):56-58.

[3] Shi Ke;Zhang Qun;Zhang Yi;Bi Yufei;Zeng Xuanwei;Wang Xianbo.Association between probiotic therapy and the risk of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis B-related cirrhosis[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology.Volume 12 , Issue. 2023. PP 1104399-1104399.

[4]Zhai Lixiang;Wu Jiayan;Lam Yan Y.;Kwan Hiu Yee;Bian ZhaoXiang;Wong Hoi Leong Xavier.Gut-Microbial Metabolites, Probiotics and Their Roles in Type 2 Diabetes.[J] International Journal of Molecular Sciences,2021

[5]D’argenio V,Sarnataro D.Probiotics,prebiotics and their role in alzheimer’s disease[J].Neural Regeneration Research,2021,16(9):1768.

[6]Hao Junyu;Zhang Yongli;Wu Tao;Liu Rui;Sui Wenjie;Zhu Jianguo;Fang Shuguang;Geng Jieting;Zhang Min.The antidiabetic effects of Bifidobacterium longum subsp. longum BL21 through regulating gut microbiota structure in type 2 diabetic mice[J]. Food & function.Volume , Issue. 2022.

[7]方曙光;郭晓娟;汪欣;朱建国.长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用[P].中国专利：CN202210449134.6，2022-08-05.

[8]李彧媛,张岩,刘赫,郭玉玲,李明,袁杰力.不同类型益生菌制剂在胃肠道中耐受程度的对比[J].中国微生态学杂志,2021,33(12):1374-1378.

[9]冯超.植物乳杆菌微胶囊制备技术及其消化道耐受性研究[D].南昌：南昌大学,2012.

[10]郭佳.膳食纤维微胶囊改善嗜酸乳杆菌NCFM存活能力的研究[D].北京：北京林业大学,2008.

[11]]后鹏飞,唐人杰,黄静,罗丹,游敬刚,陈功,史辉.益生菌青稞晶球的制备及性能研究[J].食品与发酵科技,2022,58(02):95-101.

[12]国家药典委员会中华人民共和国药典[M]．(第四版)北京：中国医药科技出版社，2015:130.

[13]贾庆超，孔欣欣．市售酸奶在贮藏过程中品质的变化[J].中国乳品工业，2020(6):26-30.

[14]邱维吉，李士通，白刚.健康志愿者液体胃排空时间：核磁共振法确定[J].中华麻醉学杂志，2015,35(1):3.

[15]凌强，孙延旭，李晓英.食品营养与卫生安全管理[M].旅游教育出版社，2014:30-30.

[l1]题目不太清晰

[l2]包埋前的菌粉和包埋后的微珠？

[l3]仅这个目的？

[l4]句子不通

[l5]确认

[l6]写全，以下同

[l7]型号

[l8]缺主语

[l9]？

[l10]活菌数需要定语