气相色谱和液相色谱法检测调味品中3-氯-1,2-丙二醇方法研究与优化

气相色谱和液相色谱法检测调味品中3-氯-1,2-丙二醇方法研究与优化

郭亚娟  高靖  白娜  张钰

广电计量检测（西安）有限公司   陕西省西安市710100 

摘要：

     基于气相色谱法和高效液相，通过优化样品前处理条件，建立了一种测定调味品中3-氯-1,2-丙二醇的方法。气相色谱检测时样品经20%氯化钠水溶液超声提取，碱性条件下经苯酚衍生后，采用Agilent HP-5  30m*0.320mm*0.25μm色谱柱进行分离，程序升温后FID检测器进行检测。该方法中， 3-氯-1,2-丙二醇在10ng~1000ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R2为= 0.9971996，方法检出限为0.05mg/kg，回收率在71.8%-107.5%之间，相对标准偏差（RSD）在1.97%-9.96%之间。液相色谱检测时样品经20%氯化钠水溶液超声提取，以高碘酸钠为氧化剂将3-MCPD分解，再以2-氨基喹喔啉为衍生化试剂，与3-MCPD的氧化产物生成强荧光性物质，该物质经Agilent  TC-C18(2)分离， Tris-HCl：甲醇=0.36:0.24（mL/min，V/V）洗脱，在激发波长318nm、发射波长367nm的条件下与其他干扰物质良好分离。该方法中， 3-氯-1,2-丙二醇在10ng~2000ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9971，方法检出限为0.10mg/kg，回收率在70.2%-104.5%之间，相对标准偏差（RSD）在4.72%-9.96%之间。这两种检测方法灵敏度高，选择性好，结果准确可靠，可同时快速检测调味品中3-氯-1,2-丙二醇的残留量。

关键词：3-氯-1,2-丙二醇，苯酚，2-氨基喹喔啉，高效液相色谱，气相色谱

     3-氯-1,2-丙二醇(3-monochloropropane-1,2-diol)， 英文缩写为3-MCPD，是甘油

即丙三醇结构链上末端羟基被氯离子亲核取代而保留1,2-位羟基所形成的化合物，结

构式为: CH2CI-CHOH-CH2OH。 3-MCPD 具有两种手性异构体，分别为(S)-(+)-3-MCPD和(R)-(-)-3-MCPD。纯净的3-MCPD是一种具有愉悦气味的无色流体，露置于空气中，逐渐变为稻草黄色。室温下(20℃)的相对密度为1.3218，折光率为1.4831。3-MCPD的沸点114~120℃，凝固点为-40℃，易吸潮。高温条件下氯丙醇不稳定，当温度达到213℃时，氯丙醇开始分解，50~100℃条件下，3-MCPD的饱和蒸汽压为0.195~5.445 mmHg。3-MCPD结构上具有较多的羟基，是种极性物质易溶于水、乙醚、乙醇和丙酮，微溶于甲苯，难溶于苯、石油醚以及四氯化碳。

      3-氯-1,2-丙二醇是国际公认的食品污染物，不仅广泛存在于油脂、调味品等产品中，更是在日常的食物加工过程中大量产生，普遍存在于所有食堂和餐馆的菜肴中，不仅具有致癌作用，还有抑制精子活性的作用，因此受到国际社会的广泛关注。《食品安全国家标准  食品中污染物限量  GB 2762-2017》规定液态调味品的最大残留量不得超过0.4mg/kg,固态调味品的最大残留量不得超过1.0mg/kg。欧盟监管委员会（EC）1881/2006号文 件 规 定3-MCPD 每日耐受摄入量/（TDI）为2μg/kg体质量；美国食品和药物管理局（FDA）也限定酱油中3-MCPD的含量在1.0mg/kg以内；联合国粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）甚至将液体调 味品中3-MCPD含量设定在0.4mg/kg以下。因此, 发展快速、准确、成本低下的残留检测方法显得尤其重要 ,也成为当前研究的热点问题。

      由于3-氯-1,2-丙二醇没有紫外吸收，同时２个羟基会产生氢键，使得3-氯-1,2-丙二醇分子极性大，难以挥发。因此，直接用GC-MS方法检测3-氯-1,2-丙二醇困难很大，主要缺点是特征离子少，而且峰形差，使得检测灵敏度较低。而现有检测方法多以d5-3-氯-1 2-丙二醇为内标定量，用七氟丁酰基咪唑溶液衍生。由于七氟丁酰基咪唑衍生试剂价格昂贵，且极易挥发，打开后不易保存，不利于实验室对3-氯-1 2-丙二醇的筛查工作。

      本项目在参考了国标及相关文献中提及的酮类、硼酸类、羧酸酐类、咪唑以及三氟乙酰胺等衍生试剂，通过改变前处理方式，找到一种更优的实验途径，将目标物3-氯-1 2-丙二醇转化成一种可以在直接在气相或液相上检测的物质，提高该项目的检测效率，降低检测成本，满足日常检测的需要。

1. 仪器与试剂

1.1 仪器：

    气相色谱： Agilent  7890B气相色谱仪（美国Agilent Technologies Inc.）,色谱柱: Agilent HP-5  30m*0.320mm*0.25μm超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），HHS电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)，XS205DU和ME204E电子分析天平（瑞士梅特勒），Milli-Q Advantage超纯水机（美国密理博）。

   液相色谱：Thermo  U3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific  公司），色谱柱:Agilent  TC-C18(2)   250mm*4.6mm*5μm,超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），HHS电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)，XS205DU和ME204E电子分析天平（瑞士梅特勒），Milli-Q Advantage超纯水机（美国密理博）。

1.2 试剂与耗材

    气相色谱：3-氯-1,2-丙二醇标准品（Dr.E，纯度99.35%，S113763），氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）乙醚（CNW，HPLC级），乙酸乙酯（CNW，HPLC级）苯酚(分析纯，阿拉丁试剂)，有机系滤膜（津腾，尼龙66，13 mm，0.22 μm）。

    液相色谱：3-氯-1,2-丙二醇标准品（Dr.E，纯度99.35%，S113763），2-氨基喹喔啉(97.0%，百灵威试剂),高碘酸钠(分析纯，阿拉丁试剂)，磷酸二氢钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）甲醇（CNW，HPLC级），乙醇（CNW，HPLC级），有机系滤膜（津腾，尼龙66，13 mm，0.22 μm）。

2. 方法

2.1对照品溶液

    气相色谱：精密称取10mg  3-氯-1,2-丙二醇标准品，用乙酸乙酯溶解并定容至10 mL。此标准贮备溶液的浓度约1 mg/ml。取100uL标准贮备溶液用乙酸乙酯稀释至10mL，得到浓度为10μg/mL的标准中间溶液备用。用乙酸乙酯将标准中间溶液稀释至约0.00μg/mI、0.01μg/mI 、0.05μg/mI、0.1μg/mI、0.5μg/mI、1.0μg/mI、2.0μg/mI。准确移取2mL标液于15mL具塞试管中，加入1mL的氢氧化钠（1g/L）溶液混匀，加入1mL苯酚（20%）溶液，混匀后取有机相过滤上机。

    液相色谱：精密称取10mg  3-氯-1,2-丙二醇标准品，用一级水定容于10mL的容量瓶中，超声波振荡混合均匀，配制成1.0mg/mL的母液。取100uL母液用一级水稀释至10mL，得到浓度为10μg/mL的标准中间溶液备用。用一级水将标准中间溶液稀释至约0.01μg/mI 、0.05μg/mI、0.1μg/mI、0.5μg/mI、1.0μg/mI、2.0μg/mI、5.0μg/mI.。准确移取2mL标液于15mL具塞试管中，加入250mM的NaIO4100uL，涡旋振荡混合均匀，避光反应30min。加入275mM的PbNO3 100uL，涡旋振荡混合均匀，室温~下静置10min左右，转移至5mL离心管中3000rpm/min离心10min。取上层清液1mL，加入2mg/mL的2-氨基喹喔啉溶液1mL，涡旋振荡混合均匀，90°C水浴反应3h.，过滤上机，经液相色谱仪-FLD检测器中检测。。

2.2样品前处理：

     气相色谱：准确称取样品2g，用20mL氯化钠溶液（20%）溶解超声混匀提取20min，20mL石油醚提取两遍，合并醚层，经无水硫酸钠脱水后，40℃水浴蒸发近干，加入2mL乙酸乙酯溶液，加入1mL的氢氧化钠（1g/L）溶液混匀，加入1mL苯酚（20%）溶液，混匀后取有机相过滤上机，经气相色谱仪-氢火焰离子化检测器中检测。

    液相色谱：准确称取样品2g，用20mL氯化钠溶液（20%）溶解超声混匀提取20min，取2mL.于具塞试管中，加入250mM的NaIO4100uL，涡旋振荡混合均匀，避光反应30min。加入275mM的PbNO3 100uL，涡旋振荡混合均匀，室温~下静置10min左右，转移至5mL离心管中3000rpm/min离心10min。取上层清液1mL，加入2mg/mL的2-氨基喹喔啉溶液1mL，涡旋振荡混合均匀，90°C水浴反应3h.，过滤上机，经液相色谱仪-FLD检测器中检测。

2.3色谱条件

气相色谱条件：采用Agilent 7890B气相色谱仪、FID检测器、Agilent HP-5  30m*0.320mm*0.25μm色谱柱、进样口温度：230℃、检测器温度：250℃、氢气流量：30mL/min空气流量：300mL/min、 尾吹：25 mL/min、升温程序：50℃（2min）以10℃/min升至200℃，以20℃/min 220℃保持2min。

     液相色谱条件：采用Thermo  U3000高效液相色谱仪（FLD检测器）、Agilent  5 TC-C18(2)   250mm*4.6mm*5μm色谱柱、流动相： Tris（三羟甲基氨基甲烷）-HCl：甲醇=0.36:0.24（mL/min，V/V）、激发波长为λex=318nm、发射波长为λEm=367nm、柱温35℃、进样量20μL。

3. 结果与分析

3.1提取条件优化：

针对3-氯-1,2-丙二醇溶于水、乙醇、乙醚和丙酮，微溶于甲苯，不溶于苯、石油醚和四氯化碳的物理特性，本研究比较了分别以纯水、10%氯化钠溶液、20%氯化钠溶液、20%乙醇水溶液、 80%乙醇水溶液等提取液，超声提取20min的提取效果，取空白基质2g，用20mL氯化钠溶液（20%）溶解超声混匀提取30min，20mL石油醚提取两遍，合并醚层，经无水硫酸钠脱水后，40℃水浴蒸发近干，加入2mL乙酸乙酯溶液，加入1mL的氢氧化钠（1g/L）溶液混匀，加入1mL苯酚（20%）溶液，混匀后取有机相过滤上机，经气相色谱仪-氢火焰离子化检测器中检测。不同溶剂对3-氯-1,2-丙二醇的提取效率如图1所示，用20%氯化钠溶液水溶液为提取溶剂时，3-氯-1,2-丙二醇的提取率最高。

图1 不同提取溶液对3-氯-1,2-丙二醇的提取效率

  为选择最优的提取时间和提取效率，以20%氯化钠溶液水溶液为提取溶剂在（200 W、40 kHz）下对比5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min超声提取时间的提取效率，结果表明在0~20 min内3-氯-1,2-丙二醇含量随着超声时间增加逐渐升高，20 ~30 min后含量基本保持稳定，30 ~60 min后含量有所下降至基本保持稳定，如图2所示。综合上述结果，考虑选用20%氯化钠溶液水溶液为提取溶剂超声萃取20 min的提取方法。

图2超声提取时间对提取效率的影响

3.2衍生试剂的选择

气相衍生试剂的选择： 国标及相关文献中提及的衍生试剂常见的有酮类、硼酸类、羧酸酐类、咪唑、酚类以及三氟乙酰胺等衍生试剂，这些试剂价格昂贵，易挥发，不易保存，故我们选择价格低廉性质稳定的苯酚作为衍生试剂，衍生得到的目标峰与干扰峰分离效果良好，可以满足要求。

图3样品的加标色谱图（峰1:1,2－丙二醇；峰2：3-MCPD ）

液相衍生试剂的选择： 通过对纯净水、丙二醇、丙三醇、氯乙醛、3-MCPD衍生化后的溶液进行高效液相色谱荧光检测。3-MCPD、氯乙醛出现尖锐的目标峰，其他三种物质均只有很小的衍生化试剂2-氨基喹喔啉的干扰峰，说明此方法具有良好的选择性。

图45种物质衍生化反应产物的高效液相色谱荧光检测色谱图

3.3线性范围、方法检出限

  气相色谱采用1,2-丙二醇做内标，内标法定量的方法，对3-氯-1,2-丙二醇进行测定，以待测物的浓度作为横坐标，待测物的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示， 3-氯-1,2-丙二醇在10ng~1000ng/mL范围内线性关系良好，得到3-氯-1,2-丙二醇的线性方程和相关系数为Y =0.7758529X + 0.8570752，R^2 = 0.9971996；选择空白基质，添加不同浓度的质量浓度，以其3倍信噪比（S/N）确定其中3-氯-1,2-丙二醇的检出限LOD为0.05mg/kg。

     液相色谱采用外标法定量的方法，根据最佳衍生化反应对3-氯-1,2-丙二醇进行测定，以待测物的浓度作为横坐标，待测物的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示， 3-氯-1,2-丙二醇在10ng~2000ng/mL范围内线性关系良好，得到3-氯-1,2-丙二醇的线性方程和相关系数为得到曲线方程分别为Y=46300.49X+55310.69，R2=0.9971，线性良好；选择空白基质，添加不同浓度的质量浓度，以其3倍信噪比（S/N）确定其中3-氯-1,2-丙二醇的检出限LOD为0.10mg/kg。

3.4方法精密度、回收率

气相色谱：通过添加低、中、高三种不同浓度质量浓度（LOQs、2×LOQs、3×LOQs），按优化的实验条件进行检测，每个添加水平做六平行，结果表明， 3-氯-1,2-丙二醇的回收率在71.8%-107.5%之间，相对标准偏差（RSD）在1.97%-9.96%之间，以上结果均符合《实验室质量控制规范食品理化检测》GB/T 27404-2008 附录F中该浓度实验室内变异系数≤11%的要求。

表1 气相色谱回收率实验结果

液相色谱：选取空白基质样品，通过添加低、中、高三种不同浓度质量浓度（LOQs、2×LOQs、3×LOQs），按优化的实验条件进行检测，每个添加水平做六平行，结果表明， 3-氯-1,2-丙二醇的回收率在70.2%-104.5%之间，相对标准偏差（RSD）在4.72%-9.96%之间，以上结果均符合《实验室质量控制规范食品理化检测》GB/T 27404-2008 附录F中该浓度实验室内变异系数≤11%的要求。

表2 液相色谱回收率实验结果

4.结论

    本项目采用20%氯化钠水溶液作为提取溶剂，用苯酚和2-氨基喹喔啉作为衍生试剂，通过更换衍生试剂，成功建立了一套稳定高效、方便快捷的调味料中3-氯-1,2-丙二醇的检测方法。本项目同时考察了酱油、料酒、五香粉、胡椒粉、芝麻酱等常见调味料，基质覆盖面广，是一套准确、高效、通用性强的检测方法。