灵归方对环磷酰胺诱导的小鼠弱精症治疗作用及相关机制的研究

灵归方对环磷酰胺诱导的小鼠弱精症治疗作用及相关机制的研究

孙明玉1 方圆1 孙铭阳1 郑荟2 隋宏书2

1. 山东第一医科大学临床与基础医学院  山东 济南250000

2.山东第一医科大学临床与基础医学院组织学与胚胎学系 山东 济南250000

【摘要】 目的 探究灵归方对环磷酰胺诱导弱精症小鼠的干预治疗作用及机制。方法 40只雄性小鼠随机分为五组：对照组、模型组、灵归方低、中、高剂量组，对后四组小鼠腹腔注射环磷酰胺建立弱精症小鼠模型，灵归方组小鼠进行灵归方灌胃4周，末次给药24h后称重麻醉取小鼠睾丸组织制作病理切片、计算小鼠精子畸形率、活动率，进行统计学分析，评价灵归方对弱精症小鼠的治疗作用。结果 模型组小鼠睾丸组织生精小管内精子数目显著减少，各级生精小管排列紊乱，精子畸形率及活动率明显下降。与模型组相比，灵归方组精子数目增多，生精小管结构规则，精子畸形率及活动率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 灵归方通过补肾益精对环磷酰胺诱导的小鼠弱精症有治疗作用。

关键词：弱精症；环磷酰胺；灵归方

中图分类号: Q813.7            文献标识码：A

第一作者：孙明玉，2019级临床医学本科专业在读本科生

通讯作者: 隋宏书，Tel：18668956682 ，E-mail:hongshusui@163.com

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2022104391195）

1. 前言

弱精症表现为精子活力低下，已成为影响男性不育的最主要因素之一。近年来，有学者从病因入手探究治疗弱精症的方法[1]，但尚无进展。灵归方是由枸杞子、菟丝子、红景天等组成的配方中药，研究表明灵归方在补肾活血、提高精子活力方面具有明显的功效[2]。因此本研究以灵归方为切入点，通过腹腔注射环磷酰胺建立小鼠弱精症模型，检测各项相关指标探究灵归方对小鼠弱精症的治疗作用。

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

40只雄性清洁级KM小鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司），9-10周龄，体重20±1.5g。动物房室温21-25℃，相对湿度50-60%，小鼠自由饮水采食。

2.1.2实验试剂

环磷酰胺粉剂（济南药店）；灵归方配方颗粒（济南药店）。

2.2弱精症模型建立

40只雄性小鼠随机均分为5组，分别为对照组、模型组、灵归方低、中、高剂量组，模型组、灵归方组腹腔注射环磷酰胺，每天1次，共14天。

2.3治疗弱精症小鼠

弱精症小鼠模型建立后进行灵归方灌胃治疗。灵归方低、中、高剂量组分别以8g/kg、14g/kg、20g/kg剂量灌胃，对照组和模型组灌胃等量生理盐水，每天一次，共4周。

2.4检测指标

2.4.1小鼠睾丸组织病理检测

末次给药后禁食24小时，取小鼠左侧睾丸组织制作病理切片，苏木素-伊红（HE）染色于显微镜下观察睾丸组织形态变化。

2.4.2小鼠精子畸形率检测

取小鼠右侧附睾尾部放入培养皿，制成精子悬液，取20l制成临时装片，油镜下观察计数精子畸形数并计算畸形率。

2.4.3小鼠精子活动率检测

取10l精子悬液加到37℃预热的精子计数板上，选取6个清晰视野计数精子数并计算活动率。

2.5数据统计学分析

实验数据处理均由SPSS27.0软件分析，作图软件选用 GraphPad Prism 8.0绘制，P＜0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠睾丸组织病理变化

图1. 各组小鼠睾丸组织病理变化（H&E染色，A. 对照组；B. 模型组；C.灵归方组）

对照组生精小管形态结构正常，充满精子细胞；模型组小鼠精子细胞数目明显减少，生精细胞排列不齐，生精小管内可见脱落的生精细胞，睾丸间质增生明显；灵归方组生精小管排列整齐，生精小管内可见较多精子。

3.2 小鼠精子畸形率的变化

图2. 各组小鼠精子畸形率的检测

与对照组小鼠相比，模型组小鼠精子畸形率升高明显；与模型组小鼠相比，灵归方组小鼠精子畸形率下降（P＜0.05），较对照组升高。

3.3 小鼠精子活动率

图3. 各组小鼠精子活动率的检测

与对照组小鼠相比，模型组小鼠精子活动率明显下降，灵归方组小鼠精子活动率较模型组明显升高（P＜0.05），较对照组小鼠降低。

4.讨论

现代医学认为弱精症的发生与生殖道感染、遗传性疾病等诸多因素有关，具体分子机制尚未清楚[3]。西医对于弱精症的疗效不够满意[4]，根据中医学观点，弱精症多为肾精气阳衰，血瘀造成睾丸、附睾等微循环障碍，进而出现弱精症[5]，因此从补肾益精活血方面入手是治疗弱精症的重要方法。研究表明，灵归方配方成分菟丝子对下丘脑-垂体-性腺轴有兴奋作用，显著提高精子活力等，枸杞多糖可改善精子细胞内线粒体活性[6]。

本实验严格按照随机化、对照重复的原则，对5组小鼠进行了模型评价，肯定了腹腔注射环磷酰胺诱导的小鼠弱精症模型的建立。灵归方组小鼠经过4周灵归方灌胃处理，生精小管内精子数目明显增加，各级生精小管形态规则，未见明显的间质增生，证明了灵归方对弱精症小鼠的干预治疗作用，治疗机制可能是通过改善肾功能，益气补精来实现的。本项目将继续深入研究其具体分子机制，为弱精症的发病机制、干预措施等研究提供新思路。

参考文献

[1]Zhang HL, Zhao LM, Mao JM, et al.Sperm retrieval rates and clinical outcomes for patients with different causes of azoospermia who undergo microdissection testicular sperm extraction-intracytoplasmic sperm injection. Asian J Androl. 2021 Jan-Feb;23(1):59-63.

[2]杜冠潮,郭俊,郭军，等.郭军教授针药并用治疗特发性少弱精子症临床经验[J].中国医药导报,2021,18(22):133-136.

[3]Schuppe HC, Pilatz A, Hossain H, et al. Urogenital Infection as a Risk Factor for Male Infertility. Dtsch Arztebl Int. 2017 May 12;114(19):339-346. 

[4]罗丽燕, 史莉. 无精子症患者生育压力对生活质量的影响及相关性 研究 [J] . 中华男科学杂志, 2018, 24 (5) : 425-430.

[5]李茂林,吴桂杰,周振环,等.颐和春胶囊对少弱精子症治疗效果的临床观察[J].中华男科学杂志,2020,26(06):543-546.

[6]仇雯丽,杨凤莲.治疗少弱精子症常用中药分子机制研究新进展[J].医学理论与实践,2021,34(20):3529-3531.

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2022104391195）