基于指纹图谱的甘草质量控制研究

基于指纹图谱的甘草质量控制研究

李彤 李文艳 齐萱歌 杜蓓*

（陕西国际商贸学院  医药学院 陕西 西安 712046）

摘要：本研究以甘草为研究对象，以甘草酸和甘草苷为对照品，采用薄层色谱法对8批不同采集地的甘草药材进行定性鉴别，254nm单波长反射方式吸收扫描，扫描速度为20mm/s，得到指纹图谱有6个共有峰，聚类分析结果正品甘草药材有较好的相似度，可对不同产地的甘草药材质量进行直观比较，该方法简便、准确、可靠，可为甘草的质量评价提供参考。

关键词：甘草；指纹图谱；薄层色谱

基金：陕西省2022年大学生创新创业训练计划省级立项项目，项目名称：基于指纹图谱结合化学模式识别的甘草质量控制研究，编号S202213123046。

作者简介：李彤，女，汉族，中药学专业2019级；李文艳，女，汉族，中药学专业2021级；齐萱歌，女，汉族，中药学专业2021级。

通讯作者：杜蓓，女，汉族，陕西渭南人，讲师，研究方向：药物活性评价。

中药甘草又名国老、密草、蜜甘和美草等[1]，为豆科植物甘草（Glycyrrhizauralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根茎，其味甘、平、无毒，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛及调和诸药等功效，俗称“十方九草”。甘草主要含三萜类和黄酮类成分[2-3]。目前多用三萜类化合物甘草酸的含量测定作为质量控制指标，大量的质量控制研究也都是围绕甘草酸的含量测定方法而进行[4-5]。国内外认同的可以全面反映中药内在质量的指纹图谱质控技术在甘草的应用则未见报道。指纹图谱可对样品的整体轮廓进行较直观的观察，着重于提取宏观规律性的特征，目前常用于中药的质量标准研究。野生甘草主要分布于新疆、内蒙古、宁夏、甘肃、山西朔州，人工种植甘草主要产于新疆、内蒙古、甘肃的河西走廊，陇西的周边，宁夏部分地区。本论文选取梁外草、王爷地草、西镇草、边草、西北草、下河川草、东北草、新疆草八种不同产地药材进行检测，以期为不同道地甘草的划分及质量评价提供理论依。

1实验材料

1.1实验仪器

全自动点样仪、双槽展开缸、薄层板（手铺硅胶板、硅胶预制板）、薄层色谱摄像系统、薄层色谱视频扫描软件、薄层加热板、电子分析天平、数控超声波清洗器等。

1.2实验试剂及药材

甲醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯等试剂均为分析纯，对照品甘草酸（纯度75%，购自成都普思生物科技有限公司）；对照品甘草苷（纯度96.4%，购自上海中药标准化研究中心）。

选取梁外草（内蒙古伊克昭盟杭锦旗）、王爷地草（内蒙古阿拉善左旗）、西镇草（宁夏盐池）、边草（陕西靖边）、西北草（甘肃民勤）、下河川草（内蒙古包头土默特旗）、东北草（内蒙古赤峰）、新疆草（新疆）八种不同产地药材8批甘草药材。

2实验方法与结果

2.1供试品溶液的制备

精密称取甘草药材粉末(过60目筛)0.5g，加入50%甲醇溶液50mL，浸泡8h后进行超声提取30min，滤过，将上清液蒸干。残渣加水20mL溶解，用水饱和正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液并用水洗涤2次，将上清液蒸干。残渣加入2mL甲醇，使其溶解并定容，过0.45µm滤膜，滤液作为供试品溶液。

2.2对照品溶液的制备

以甲醇为溶剂，分别配制下列浓度的对照品溶液：2.0mg/mL甘草酸、2.0mg/mL甘草苷。

2.3色谱条件

将8批次药材药品及对照品用CAMAG Linomat5半自动点样仪带状点样3μL于聚酰胺薄膜上，点样后展开，展距为9cm。待溶剂前沿到达指定位置后，取出薄层板，晾干。然后进行薄层扫描，扫描条件为254nm单波长反射方式吸收扫描，扫描速度为20mm/s。Wincats软件自动进行数据处理。

2.4方法学考察

2.4.1精密度考察

精密称取甘草供试品粉末0.5g，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样测定6次，以5号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于1.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性考察

精密称取同一批甘草供试品粉末6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，以5号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.53%，相对峰面积的RSD均小于2.7%，表明该方法重复性良好。

2.4.3稳定性考察

取甘草供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、12、24h进样测定，以5号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.85%，相对峰面积的RSD均小于2.83%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5甘草药材指纹图谱的建立

由于大多数峰没有达到与基线分离，而且峰形宽窄不一，用峰面积表达各峰之间的比例关系并不

准确。因此采用峰高值表达，取Rf在0.15～0.85的色谱峰进行分析，得到6个共有峰，其分离度分别为：0.9、1.4、0.8、0.7、0.6、0.5。指纹峰中甘草酸的分离度最好，所以取甘草酸作为参照物，计算各峰的相对比移值和相对峰高。

2.6聚类分析

采用SPSS22.0软件，以8批甘草共有峰的峰面积为变量，采用组间平均数连接法生成聚类分析图。当分类距离为20时，S1～S5、S8号样品聚为一类，S6、S7号样品聚为一类；当分类距离为15时，S1～S3号样品聚为一类，S4～S5、S8号样品聚为一类，S6、S7号样品聚为一类。

2.7薄层扫描三维指纹图谱

同板测定8批甘草样品，通过软件自动生成原点到溶剂前沿的指纹图谱，根据各样品共有峰峰高的直观比较，可以更方便的进行甘草质量评价及控制。8批样品的测定结果可以得出，甘草药材道地产区的梁外草、王爷地草的主要特征峰峰高明显高于其他样品。

采用薄层色谱配描仪，选取固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描得到的扫描图谱，比目测的层析图谱更为客观准确。其次，薄层色谱具有方法简便、设备价廉、多路柱效应、分析速度快等优点，便于推广及应用，尤其适合GAP基地和中成药企业对大批原料药材进行质量控制。

综上所述，本研究采用指纹图谱技术对不同产地甘草的质量进行研究，可快速筛选出质量差异标志物，该方法简便、准确、可靠，可为甘草的质量评价提供参考依据。

参考文献

[1]陈子珺，路舒黎.“国老”甘草：味道甘甜，运用广泛[J].中医健康养生，2022，8（4）：29-30.

[2]李泽宇，郝二伟，李卉，等.甘草配伍应用的药理作用及机制分析[J].中国实验方剂学杂志，2022，28（14）：270-282.

[3]王兵，王亚新，赵红燕，等.甘草的主要成分及其药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2013，34（3）：215-218.

[4]郑云枫，孙捷，段伟萍，等.光果甘草三萜皂苷类化学成分研究[J].药学学报，2021，56（1）：289-295.

[5]陈玉娥，冯冲，杨诗慧，等.不同产地甘草药材质量评价[J].安徽农业科学，2023，51（01）：183-187.