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摘要: 目的研究宝可依及对去卵巢后雌性SPrague -Dawley (SD)大鼠生殖道组织萎缩、衰老的作用效果。 方法选取10月龄SD雌性大鼠30只作为本次研究对象,随机分为假手术组(10只)、模型组(10只)、宝可依组(10只)。假手术组行手术但不切除卵巢,其余组别大鼠经卵巢切除手术建立生殖道衰老萎缩动物模型。假手术组和模型组不给予受试物。宝可依组连续予以受试物宝可依30d。比较3组大鼠一般情况、阴道PH值、阴道上皮及分泌物、阴道黏膜厚度、超氧化物歧化酶水平(SOD)、阴道糖原和弹力纤维的变化情况。 结果去卵巢后,模型组和给予受试物前的宝可依组,两组大鼠阴道PH值较前升高,阴道健康状况变差,生殖道SOD活性降低,组织切片观察发现有炎性改变,组织细胞萎缩明显,糖原和正常弹力纤维数量均明显降低,模型组与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)。给予受试物前的宝可依组与假手术组比较有显著性差异(P<0.05);给予受试物宝可依后,宝可依组大鼠阴道PH值下降,阴道健康评分增加,生殖道组织SOD活性升高、生殖道组织萎缩状况改善,阴道上皮糖原含量增加,弹力纤维数量增加,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),并达到或接近假手术组水平。 结论 宝可依具有明显降低阴道PH值、改善生殖道健康状况、抗生殖道衰老、增加阴道组织弹性、增加阴道上皮糖原含量的作用,对预防和治疗萎缩性阴道炎的发生具有较好效果。
关键词: 宝可依;去卵巢大鼠;生殖道衰老;萎缩;糖原;弹力纤维
萎缩性阴道炎过去多称为“老年性阴道炎”,易发于绝经期前后的妇女,也可发生于手术切除双侧卵巢或盆腔放疗所引起的卵巢功能破坏,以及卵巢早衰的中青年妇女。由于雌激素水平降低,加之炎性刺激和阴道壁退化,患者表现为外阴瘙痒、阴道干燥灼痛、性交疼痛、同房出血、白带异常等,严重影响患者的健康和生活质量,发病率高达30% ~ 58. 6%[1-2]。近年来研究表明,对于萎缩性阴道炎的治疗,除了需要改善生殖道环境,降低阴道PH、改善生殖器萎缩也非常关键。目前针对萎缩性阴道炎、生殖道衰老状态,临床治疗主要用雌激素加抗生素,其短期疗效尚可,但易复发,长久使用副作用大。长期使用雌激素导致乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌,以及心脏病深部静脉血栓肺栓塞等疾病患病风险增加。抗生素在抑制致病菌的同时也对阴道正常菌群产生不利影响,加重阴道菌群失调,破坏阴道内环境。目前的治疗手段均都不能解决生殖器萎缩这个引发萎缩性阴道炎的根本问题。
在过往的临床研究中显示出了宝可依作为一种新型的制剂,对萎缩性阴道炎的治疗安全有效,同时可避免了雌激素的副作用。本研究采用去卵巢后雌性SPrague -Dawley(SD)大鼠作为实验对象,考察宝可依对阴道组织萎缩、衰老状况的作用效果,进一步探讨宝可依抗雌性生殖衰老的作用,为宝可依临床用于治疗萎缩性阴道炎提供基础性依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级SD雌性大鼠,未孕,10月龄,体质量 200-250g,平均体质量为(248. 21±16. 14)g,30只。济南朋悦实验动物繁育有限公司提供(许可证号:SCXK(鲁)20140007)。购回后均饲养3d后进行实验,光照时间早上7时到晚上6时,室温为 22℃,统一饲料,自由饮水摄食。3组大鼠在雄雌、月龄、体质量等基本资料及喂养条件比较差异无显著性 (P>0.05),有可比性。
1.2 药品及试剂
受试物:宝可依凝胶,百幸药业(东莞)有限公司提供。
1.3 实验方法
1.3.1 建立动物模型
选取SD大鼠,麻醉,开腹,分离和剪取卵巢,缝合。术后大鼠均予以62.5万单位青霉素0.2mL腹腔注射,连续3d。术后5d阴道涂片,1次/d连续5d,以未出现动情期反应为建立动物模型成功。假手术组大鼠也行手术,不切除卵巢,仅去部分脂肪后直接缝合,术后予以腹腔注射2万单位青霉素。所有大鼠在进行手术后均行30d自然喂养,使对模型组、宝可依组(给予受试物前)大鼠的生殖器达到衰老萎缩的状态。
1.3.2 给药剂量与方法
宝可依组每日阴道给予受试物0.1mL,相当于10倍成人用量;每次用一次性1mL规格注射器 (去针头) 向动物阴道内推入给予受试物一次,完后用特制小棉栓堵住大鼠阴道口,以防给受试物流出。连续给予受试物30d。假手术组和模型组不给予受试物。
1.4实验观察指标和方法
1.4.1 一般情况
观察大鼠的体型、体重及行为变化。
1.4.2 连续阴道涂片的观察
卵巢切除后5d,逐只进行阴道涂片检查,每天一次,看卵巢切除是否完全。卵巢去除完全的大鼠连续阴道涂片应呈持续动情间期。给予受试物前一周再给模型组和宝可依大鼠逐只做阴道上皮脱落细胞涂片,每日一次,连续5d。停止给予受试物前再阴道涂片连续观察5d。涂片方法:用消毒棉签蘸一下生理盐水缓慢旋转插入动物阴道内,然后在阴道内轻轻转动几下取出涂片,然后将涂片在酒精灯上烤干固定。用碱性美蓝溶液染色5min,用蒸馏水冲洗,晾干。在显微镜下观察。给予受试前及处死前的涂片方法相同。
1.4.3 阴道PH值及生殖道健康评分
用镊子夹住细短条的PH试纸,接触大鼠阴道内,测定阴道PH值,并仔细观察大鼠阴道及分泌物情况,进行生殖道健康评分,判断生殖道健康状态及阴道萎缩程度。
表1 生殖道健康评分
0分 | 1分 | 2分 | 3分 | 4分 | |
阴道PH值 | ≥7.5 | ≥6.6 | 5.6~6.5 | 4.7~5.5 | ≤4.6 |
分泌物量、性状及粘稠度 | 无 | 极少,薄,呈黄色 | 很薄,表浅,呈白色 | 中等量及厚度,白色 | 正常絮状,白色 |
上皮黏膜 | 可见粘着的剥脱的表皮 | 在接触前后可见瘀斑 | 轻触后有出血 | 中等量及厚度,白色 | 正常黏膜及脆性 |
湿润度 | 干涩 | 无 | 很少 | 中等 | 正常 |
阴道褶皱 | 无 | 极少 | 少量 | 中等 | 去势前水平 |
黏膜颜色 | 糜烂 | 炎性充血 | 苍白 | 基本正常 | 去势前水平 |
1.4.4 生殖道(子宫、阴道)超氧化物歧化酶(SOD)测定
最后一次给予受试物24h后,处死大鼠,剥离子宫和阴道,取子宫、阴道各一段以4℃生理盐水冲去血液,滤纸吸去多余水分,电子天平共同称重。用液氮迅速冷冻保存备用。使用时标本融化后仍然保持2-8℃的温度。用眼科剪剪碎后加入9倍于组织重量的生理盐水,匀浆、离心、收集上清,按照SOD试剂盒(羟胺法)、MDA试剂盒(TBA法)操作进行SOD和MDA的检测。
1.4.5组织学观察
将阴道、子宫新鲜组织用中性甲醛固定后制成石蜡切片,常规HE染色,观察组织形态学变化。取阴道0.5cm,以Carnoy固定做PAS(过碘酸雪夫氏反应)观测上皮细胞内糖原含量;取阴道0.5cm,以Susa固定做Gomori氏(醛复红染色法)染色,以观察阴道组织弹力纤维变化。
1.5统计学处理
数据处理使用SPSS 22. 0软件,计数资料以 ( % ) 表示,以独立样本2 检验;计量资料结果以“均数±标准差”(±s)表示,多组比较以F检验,两两比较以t检验,当P<0. 05表示差异有显著性。
2实验结果
2.1对生殖道衰萎大鼠一般情况的影响
假手术组动物皮毛色泽、体形正常;去卵巢后给予受试物前,模型组和宝可依组动物皮毛粗糙无光泽,体形明显增大,瘙痒搔抓动作频繁;给予受试物后,宝可依组皮毛虽略微粗糙但较前明显改善,体形虽有增大,但远不如模型组明显,几乎未见瘙痒动作。
2.2 阴道PH值及给药前后PH值的比较
各组大鼠阴道PH值及给受试物前后阴道PH值的结果见表2 。
表2 对生殖道衰老萎缩大鼠阴道PH值的影响(±s)
组别 | n | 阴道PH值 | |
给予受试物前 | 给予受试物后 | ||
假手术组 | 10 | 5.06±0.56 | 5.75±0.58 |
模型组 | 10 | 6.95±0.37* | 7.70±0.42* |
宝可依组 | 10 | 6.85±0.34* | 5.55±0.75△□ |
*与假手术组比较,*P<0.05;△与模型组比较,△P<0.05;□与本组给受试物前对比,□P<0.05
表2显示,给予受试物前,由于去卵巢造模,各组大鼠阴道PH值明显高于假手术组,有显著性差异(P<0.05);
给予受试物后,宝可依组大鼠阴道PH值低于模型组阴道PH值,有显著性差异(P<0.05);
宝可依组给予受试物后阴道PH值较给予受试物前明显降低,有显著性差异(P<0.05),提示生殖道萎缩衰老炎症的大鼠使用宝可依后生殖器萎缩情况以及阴道PH值得到了有效改善。
2.3 宝可依对生殖道衰老萎缩大鼠阴道健康状况的影响
表3 对生殖道衰老萎缩大鼠阴道健康状况的影响(±s)
组别 | n | 阴道健康状况评分 | |
给予受试物前 | 给予受试物后 | ||
假手术组 | 10 | 21.63±1.92 | 20.63±1.60 |
模型组 | 10 | 7.90±1.66* | 6.30±1.42* |
宝可依组 | 10 | 7.90±1.52* | 18.90±1.33△□ |
*与假手术组比较,*P<0.05;△与模型组比较,△P<0.05;□与本组给受试物前对比,□P<0.05
表3显示,假手术组动物给药前阴道健康状况良好,阴道健康评分明比其它各组显高;给予受试物前,由于去卵巢后雌激素水平下降导致阴道健康状况不佳,模型组的阴道健康评分均比假手术组低,有显著性差异(P<0.05);给予受试物后,由于模型组实际上没有给任何受试物,所以与宝可依组比较,随着衰老萎缩变化,阴道健康水平也降低明显;宝可依组给予受试物后的健康评分比模型组高,有显著性差异(P<0.05);且较给予前阴道健康评分大大提高,有显著性差异(P<0.05)。说明受试物宝可依对阴道的健康状况有明显的改善作用,接近假手术组(卵巢健在)的健康程度。
2.4 宝可依对生殖道衰老萎缩大鼠阴道组织SOD(超氧化物歧化酶)活性的影响
表4 对生殖道衰老萎缩大鼠阴道组织SOD的影响(±s)
组别 | n | SOD活性(nμ/mL) |
假手术组 | 10 | 183.79±10.84△ |
模型组 | 10 | 105.35±11.71* |
宝可依组 | 10 | 133.11±4.35*△ |
*与假手术组比较,*P<0.05;△与模型组比较,△P<0.05;
□与模型组、宝可依组给药前后对比,□P<0.05
表4显示, 宝可依组的SOD活性高于模型组,有显著性差异(P<0.05),说明宝可依有抗阴道衰老作用作用。
2.5对生殖道衰萎大鼠生殖道组织细胞的影响(HE染色)
给药结束后,断头处死动物,取动物子宫及阴道组织作石蜡切片。
(1)子宫组织病理切片HE染色结果:
模型组细胞明显小于其他各组,胞浆少,核固缩,子宫内膜萎缩变薄明显,仅残留少而细小的腺体。约20%的腺体有分泌现象,大部分间质细胞小,呈短梭型,胞浆少,毛细血管少。
假手术组,宝可依组子宫直径较粗,内膜腺体较丰富, 内皮较厚,间质致密。
说明了宝可依能延缓和逆转子宫萎缩。
阴道组织病理切片HE染色:
假手术组大鼠阴道粘膜向腔内凸起,形成高低不等的皱襞,粘膜表层被覆单层柱状上皮,浅层胞质较透明,固有层为致密结缔组织。
模型组:阴道粘膜有局限性或弥漫性病变、坏死,且凋亡细胞多见,大量炎症细胞浸润,以淋巴细胞为主,并有中性分叶核、单核细胞、浆细胞等炎症细胞浸润。
宝可依组:阴道上皮细胞轻度凋亡脱落,炎性浸润,组织充血,粘膜水肿等病变有不同程度减轻,部分受试动物无明显炎症反应。
说明了去卵巢后衰老大鼠发生了萎缩性阴道炎,宝可依可以减轻、消除这种阴道炎性改变。
2.6对生殖道衰萎大鼠阴道黏膜厚度的影响(HE染色)
每例标本镜下定位,以粘膜最厚、最薄及中间厚度三处测量厚度,假手术组观测24个野,其余每组观测30个视野(即PF×30),其厚度用mm表示。
表5 对生殖道衰老萎缩大鼠阴道黏膜厚度的影响(±s)
组别 | n | 平均黏膜厚度(mm) |
假手术组 | 10 | 16.06±3.55 |
模型组 | 10 | 6.05±0.59* |
宝可依组 | 10 | 48.41±4.86*△ |
*与假手术组比较,*P<0.05;△与模型组比较,△P<0.05
表5显示,模型组阴道粘膜厚度较假手术组低,有显著性差异(P<0.05);宝可依组阴道粘膜厚度与模型组比较差异显著(P<0.05)。说明受试物对阴道粘膜的厚度具有有利的影响。
2.7 对生殖道衰萎大鼠阴道组织糖原的影响
糖原含量PAS染色以细胞内出现红色或紫色颗粒为阳性反应,评分分级如下:++++ 细胞浆内呈鲜红色,或整个细胞浆内充满颗粒,有部分是粗大的颗粒。+++ 细胞浆内呈中等弥漫红色,或部分胞浆内有许多紫红色颗粒。++ 胞浆内呈红色,或有少数紫红色颗粒。+胞浆内有淡红色,未见颗粒。
应用SPSS 22.0统计软件建立数据库,本项数据为等级资料,用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验进行统计分析。
表6 对大鼠阴道上皮细胞糖原含量的影响(Kruskal-Wallis H检验)
组别 | n | 糖原含量反应 | 平均秩 | |||
++++ | +++ | ++ | + | |||
假手术组 | 10 | 0 | 3 | 4 | 1 | 25.44 |
模型组 | 10 | 0 | 0 | 2 | 8 | 9.80* |
宝可依组 | 10 | 4 | 4 | 2 | 0 | 40.20*△ |
*与假手术组比较,*P<0.05;△与模型组比较,△P<0.05
可以看出,模型组的糖原含量远低于其它各组,与其它组比较差异显著(P<0.05)。宝可依组高于模型组有较强的显著性差异(P<0.05)。说明宝可依能增加阴道上皮细胞内糖原。
2.8 对生殖道衰萎大鼠阴道组织弹力纤维的影响
组织切片以Gomori氏法染色,每组用高倍镜观察10个视野(即HPFx10),并数出每组弹力纤维的(非卷曲、断裂、无变性崩解)条数,进行对比,统计学处理。
表7 宝可依对生殖道衰老萎缩大鼠阴道组织弹力纤维的影响(±s)
组别 | n | 平均黏膜厚度(mm) |
假手术组 | 10 | 9.33±1.05 |
模型组 | 10 | 3.58±0.50* |
宝可依组 | 10 | 10.98±1.45*△ |
*与假手术组比较,*P<0.05;△与模型组比较,△P<0.05
表7显示,模型组正常弹力纤维条数假手术组,显著性差异(P<0.05);宝可依组的正常弹力纤维条数高于模型组,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。
经弹力纤维染色,电镜下观察(10×40倍):
假手术组:阴道粘膜固有层中有丰富的弹力纤维,较纤细。在阴道粘膜皱襞处,有较多伸展的弹力纤维,固有膜深层弹力纤维丰富较褶襞处粗,并有丰富的血管,有多灶性断裂,形成卷曲结构,血管内膜弹力纤维正常。
模型组:较多弹力纤维呈现卷曲状形态,表明弹力纤维发生了多灶性断裂,并有节段性崩解,血管壁弹力纤维断裂明显。
宝可依组:固有膜浅层弹力纤维细,伸展。这种结构在褶襞处较多,与假手术组组相似,深层弹力纤维较浅层粗。有呈卷曲状的弹力纤维结构,节段性崩解较不明显,血管壁弹力纤维变化不大。
3 讨论
3.1 宝可依与阴道微生态
结果显示,宝可依有较好的降低阴道PH的作用,效果优于模型组,并接近假手术组水平。分析其作用机制是通过本身的PH调节和有益阴道乳酸菌生长的作用来调节阴道内环境。宝可依发挥了类雌激素样调节作用促进上皮细胞皮合成和聚集大量糖原,糖原在阴道杆菌的作用下转变为乳酸,使阴道保持酸性,PH下降;宝可依含有阴道乳酸杆菌需要的营养物质,相当于乳酸菌的益生元,并且宝可依的PH为弱酸性 有利于乳酸菌的大量生长,有着优势地位的乳酸菌又能够抑制杂菌的繁殖,加之宝可依本身呈弱酸性(PH≤4.5)有调节阴道PH值的作用,因此宝可依 对维持阴道的内环境起到积极作用。
3.2 SOD与宝可依抗衰老
SOD 即超氧化物歧化酶,是反映组织抗氧化能力的重要指标,抗氧化能力越强SOD值越高,抗衰老的能力就强。随着年纪增长,机体内SOD活性降低,并形成衰老的征相之一[3-4]。
大鼠摘除卵巢后机体会产生大量自由基,会使生殖功能衰退、生殖器官萎缩,因此,调控 衰老因子水平变化对萎缩性阴道炎的治疗具有重要意义。实验结果显示,使用宝可依后宝SOD活性明显升高,能够达到假手术水平,说明宝可依可改善衰老因子,能够升高去卵巢生殖道衰老萎缩大鼠生殖器官SOD活力,抑制自由基在生殖器官的堆积,保护核酸、蛋白质、脂质、糖类等大分子物质,从而防止细胞老化退化,具有良好的的抗衰老作用。
3.3 弹力纤维与宝可依抗阴道萎缩
当阴道衰老、萎缩时,弹力纤维发生变化,表现为卷曲,断裂,崩解,完整的弹力纤维数目减少,阴道壁弹性下降。通过病理切片观察发现: 宝可依具有修复阴道粘膜,增加阴道糖原及改善阴道弹力纤维的作用,效果明显,能够达到假手术水平。
综上所述,宝可依对受试动物阴道机能有着多层次、多环节性的改善作用,宝可依作为治疗萎缩性阴道是良好的方案,并且适合长期的保养使用,其优点在于:1、良好的促乳酸杆菌、抗病原菌的阴道微生态调节作用。2、在延缓和逆转生殖器萎缩的同时,长期使用不会导致子宫内膜异常增厚,避免了使用雌激素造成的安全性问题。3、凝胶制剂,局部使用,无刺激性,增加阴道的润滑,特别适合老年干涩阴道。4、改善衰老萎缩阴道组织的松弛状态,增加阴道弹性。5、修复损伤的阴道组织,并有抗氧化衰老的作用。其于生殖道的黏膜改善作用的理论基础即:抗氧化衰老,改善生殖道组织细胞功能和状态,补充阴道内糖原,增加阴道组织弹力纤维数目。宝可依所表现出来对生殖道抗萎缩衰老的作用表现具有十分广阔的临床应用前景,对国内外临床医学界颇感棘手的生殖道早衰、围绝经综合征的预防和治疗,具有着有重大的意义。
参考文献
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