P53基因codon72与心肌纤维化的相关性分析

P53基因codon72与心肌纤维化的相关性分析

刘学 齐月平 张秀红 李志宇 李丹 滕海龙

牡丹江心血管病医院，药剂科（黑龙江 牡丹江）  157000

【摘要】目的 探讨P53基因codon 72密码子等位基因编码氨基酸多态性对心肌纤维化的影响。方法 选取我院近3年心肌纤维化（MF）手术患者30人，术中取心肌组织经实时荧光PCR（Q-PCR）技术确定P53基因codon72密码子的表现型，SPSS 20.0软件进行统计学分析。另取心脏外科手术患者外周静脉血150例，Q-PCR检测基因多态性。术后经MRI检查是否发生心肌纤维化，统计学分析。结果 MF组SNP基因分型Arg/Arg 6人，占总数20.0%。Arg/Pro 11人，占总数36.7%。Pro/Pro 13人，占总数43.3%。取外周静脉血样本经Q-PCR检测为Arg/Arg 47人，占总数31.3%，Arg/Pro 74人，占总数49.3%，Pro/Pro29人，占总数19.3%。经MRI检查术后心肌纤维化确诊14人，对应基因型分别为Arg/Arg 3人，占总数21.4%、Arg/Pro 5人，占总数35.7%、Pro/Pro 6人，占总数42.9%。经统计学分析表明，表现型为Arg/Arg的野生基因型发生心肌纤维化概率明显低于Arg/Pro+ Pro/Pro的突变型，两组数据经统计学分析发生风险存在差异（P<0.05），具有统计学意义。结论 P53基因 codon 72 密码子编码的氨基酸表现型与机体组织发生病理性纤维化的相关性显著，表现型为Arg/Arg的纯合子更能有效抑制纤维束的形成，降低术后心肌纤维化发生的风险。  

【关键词】：P53基因，密码子，PCR，纤维化

【中图分类号】R972    【文献标识码】A

基金项目：黑龙江省卫生健康委科技计划（20211313010115）

心肌纤维化（Myocardial fibrosis）是各种慢性心肌损伤引起的组织修复过程中，多因素共同导致心肌内肌肉组织异常增生的病理性病变。随着纤维化的持续加重，最终可导致心肌梗塞的发生，严重威胁生命安全。P53基因是细胞核内的抑癌基因，对细胞增殖起负性调节作用。该基因分为突变型和野生型两种。突变型P53基因主要是促进细胞生长，与肿瘤的发生密切相关。野生型P53基因对细胞生长起到负调控和细胞凋亡的作用。该基因的负向调节很大程度上可减小心肌纤维化的发生并能起到提前预防作用。

材料与方法

一、材料

1.1 仪器与试剂

GESigna HDxt 3.0T 核磁共振仪（美国GE公司）；GENTIER-96E型荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司）；-70℃冰箱，低温高速离心机（赛默飞世尔公司）；DNA/RNA核酸提取试剂盒（武汉明德生物科技有限公司）；TRIZOL试剂（赛默飞世尔公司）

1.2实验样本及分组

30例取心肌组织患者中男性14人，女性16人，年龄41-63（48.9±8.4）周岁，150例取外周静脉血患者，男性79人，女性71人。年龄34-66（51.9±5.5）周岁。两组患者在自然情况和既往病史等方面无明显差异（P＞0.05），排除肿瘤细胞等对实验结果可能产生影响的因素，两组数据具有可比性。  

二、方法

2.1 实时荧光定量PCR法检测心肌组织P53基因codon72编码多态性

2.1.1 心肌组织取样与保存

    取术中心肌组织约200mg，生理盐水冲去表面血液、脂肪等物质，放入RNase Free试管低温保存并迅速转入-75℃冰箱，备用，避免RNA降解。

2.1.2 PCR引物的设计与合成

    参考相关文献，采用Primer5软件在P53基因codon 72密码子4外显子的上下游分别设计引物，上游引物序列：5'-TGCCGTCCCAAGCAATGGAT-3'，下游引物序列：5'-CTGGGAAGGGACAGAAGATGA-3'，由金斯瑞生物工程有限公司合成。

2.1.3 Q-PCR检测心肌组织基因多态性

取出-75℃冰箱保存样本，快速充分研磨后倒入离心管中，加入2mL TRIZOL试剂，振荡15min，静置15min，充分裂解。12000rpm，4℃离心5min。取上层清液加入0.5μL氯仿，均匀振荡10min，室温静置15min。12000rpm，4℃离心10min，取上层水相，放入离心管中保存。加入1mL异丙醇，混均室温静置10min，12000rpm，4℃离心10min，弃上清液取底层沉淀，得RNA。加入2mL 75%乙醇轻摇离心管混悬沉淀，8000rpm，4℃离心10min，弃上清，室温干燥。

取干燥后RNA和核酸提取反应液20μL于PCR反应管中溶解，加入上游引物、下游引物各1μL盖紧管盖，离心，移至扩增区进行Q-PCR检测。逆转录50℃，15min；预变性95℃，30s；循环內变性95℃，25s；循环内退火延伸40s共40循环；72℃再延伸5min。FAM染色通道扩增表示Arg纯合子，HEX染色通道扩增表示Pro纯合子，双通道染色代表Arg/Pro杂合子。统计学分析。

2.2外周静脉血患者P53基因多态性检测

外周静脉血样本共150例。按2.1.3相应步骤进行操作，记录结果并分组，进行统计学分析。

2.3 MRI检测患者术后心肌纤维化情况

    取外周静脉血患者术后1周进行MRI检查，依据是否发生心肌纤维化分成2组，与外周静脉血基因型分组进行统计学分析。实验数据各组间进行卡方检验，P<0.05具有统计学意义。

三 结果

3.1 心肌组织P53基因多态性表达

Q-PCR检测结果发现，心肌纤维化30人中Arg/Arg纯合子6人，占样本总比例20.0%。Arg/Pro杂合子11人，占样本总比例36.7%。Pro/Pro纯合子13人，占样本总比例43.3%。

3.2取外周静脉血患者P53基因多态性表达

Q-PCR对外周静脉血样本进行检测发现，基因表现型为：Arg/Arg 47人，占总人数31.3%、Arg/Pro 74人，占总人数49.3%、Pro/Pro 29人，占总人数19.3%。经MRI对患者进行检查发现，术后心肌组织产生纤维化病变的有14人，对应基因型分别为Arg/Arg 3人，占总数21.4%、Arg/Pro 5人，占总数35.7%、Pro/Pro 6人，占总数42.9%。

3.3 实时荧光PCR检测结果分析

如表1所示，基因表现型为Arg/Arg的术后患者与基因表现型为Arg/Pro+Pro/Pro的患者相比，发生心肌纤维化的风险存在差异且具有统计学意义，并明显低于基因型为Arg/Pro+Pro/Pro的患者（P<0.05）。Arg/Arg的纯合子与其他基因型相比较，对机体组织纤维化增生具有负相关性。经统计学数据处理，本实验方法的阳性预测值为3/29=103.4/1000，阴性预测值为110/121=909.1/1000。

表1.静脉血患者Arg/Arg基因型与Arg/Pro+Pro/Pro基因型比较

Tab1.Comparison of Arg/Arg genotype and Arg/Pro+Pro/Pro genotype in patients

a卡方检验，P<0.05

四 讨论

心肌纤维化是临床上常见的心血管系统疾病，通常由炎症和外部损伤引起结缔组织钙化，影响器官正常功能。主要以心内膜增厚、心肌扩大和心衰为主要临床表现。当前常用的检查方法有定量测量胶原相关代谢物、心脏核磁共振成像和心肌声学密度等，发生机制目前尚不完全明确。有学者认为野生型P53基因codon 72密码子具有引导细胞凋亡，抑制机体组织结构增生和过度繁殖的作用，但该基因表达的蛋白与心肌纤维化的关联作用鲜有报道。因此研究P53基因对心脏术后重构及抑制纤维化的发生具有重要临床意义。P53基因促进细胞凋亡的路径主要是通过抑制G1期周期依赖蛋白性激酶（Cyclin/CDK）的合成，功能蛋白不能进行表达而导致细胞停滞于G1期。同时，P53基因的表达还能对增值细胞抗原（PCNA）产生影响，通过掩饰该抗原的某些功能基团，抑制DNA聚合酶的生成，从而阻碍细胞过度增殖。因此，野生型P53基因对术后心肌细胞的过度增殖与诱导凋亡起重要作用。Shimizu H等学者发现，精氨酸酶活性表达的提高使部分细胞出现衰老和功能障碍，在这一表达过程中P53途径与精氨酸酶的产生密切相关。

本实验研究实时荧光PCR对受损心肌组织细胞和非术后患者外周静脉血进行检测，观察P53基因codon72密码子编码的不同氨基酸型与细胞增生的相关性。结果表明，P53基因codon 72密码子所编码的氨基酸不同对心肌细胞纤维化的影响也不同。心肌纤维化组中，氨基酸表型Pro/Pro+Arg/Pro（92%）的突变型比例明显高于野生型的Arg/Arg（8%）。而对照组中表现型为Arg/Arg的纯合子（80%）所占比例明显高于Pro/Pro+Arg/Pro（20%）的突变型。术前外周静脉血样本氨基酸表现型检测分组为Arg/Arg16人、Arg/Pro11人、Pro/Pro23人，该组术后MRI检测心肌纤维化发生情况为Arg/Arg14人、Arg/Pro12人、Pro/Pro24人，经统计学分析P>0.05两组无差异，说明术前预判发生比例与实际发生情况相符，证明P53基因对氨基酸表达的控制能有效影响心肌组织细胞增生的发生。

综上所述，通过实时定量PCR技术对人类P53基因codon72编码氨基酸的多态性进行分析，能够快速、可靠的对心肌细胞纤维化做出预测和判断。为进一步研究特定基因在心血管疾病中的作用机制和发病机理提供新的理论依据和研究思路。

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作者简介：第一作者 刘学（1985-），男，硕士研究生，副主任药师，工程师

通讯作者 滕海龙（1971-），男，主任药师