连翘内生细菌的分离纯化及抑菌活性初探

连翘内生细菌的分离纯化及抑菌活性初探

朱亦凡 崔春晓

山东协和学院   山东济南250014

摘要：从连翘茎、叶中分离内生细菌，可以丰富植物的内生菌资源，开发潜在的抑菌药物。本实验将经表面消毒的连翘茎段与叶片接种至营养琼脂平板，得到连翘内生细菌群，并分离得到内生细菌。用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为抑菌活性指示菌，采用扩散培养法，检测分离得到内生细菌的抑菌活性。我们从连翘中分离得到5株内生细菌，叶片三株编号为FSL-1、FSL-2、FSL-3，茎段两株编号为FSS-1、FSS-2，五株菌株均为革兰阴性杆菌。经检测，FSL-2菌株对大肠杆菌有明显抑菌活性。

关键词：连翘；内生细菌；抑菌活性

引言

植物内生菌（Endophyte）是指那些在其生活史中某一段时期生活在活的植物组织中，使植物免受外部细菌入侵，并与植物互惠共生的菌。在植物-微生物互作过程中，由病原微生物引起的病害严重影响作物的产量和品质，而植物组织中的有益内生菌则在植物促生和抗病反应中发挥着重要作用。中药材内生菌通过产生多种生物活性物质，调控植物的次生代谢通路，诱导中药材生物活性成分的合成，是发现活性先导化合物的重要天然产物资源库。连翘叶有清热解毒的功效。连翘提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。本实验根据连翘的特性，采用研磨法与组织分离法将连翘内生菌分离，得到内生菌后进一步进行菌株的抑菌活性鉴定，以期丰富植物内生菌资源，并挖掘抑菌内生菌。

１材料与方法

1.1材料

1.1.1材料的采集

连翘材料采自山东协和学院校园内，2023年9月6日采集连翘侧枝（带叶），采样后立即带回实验室。

1.1.2 培养基成分及组成

分离纯化用的固体培养基：营养琼脂培养基（NA）、

含病原菌的培养基：取大肠杆菌菌种和金黄色葡萄球菌菌种分别加入经过121℃高压灭菌冷却后的NA培养基中，震荡均匀。

1.1.3 供试病原菌

大肠杆菌（Escherichia coli.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均为山东协和学院医护实验中心保存。

1.2仪器与设备

JHT-SSC净化工作台、SL-N电子天平、CCS45恒温培养摇床、YXQ-LS-75SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅、SK-1恒温磁力搅拌器、SPX-100生化培养箱、Haier电冰箱、研钵、移液枪。

1.3试剂

75%酒精、0.5%新洁尔灭溶液、草酸铵结晶紫染液、番红复染液、Lugol’s碘液、番红水溶液。

1.4实验方法

1.4.1茎段的内生细菌分离

取采集新鲜的连翘枝条，用自来水冲洗干净之后带入无菌操作室，用浓度为75%的酒精浸泡3min后，用无菌水冲洗3~4次，用浓度为0.1%的新洁尔灭漂洗3min，再用无菌水冲洗4次。按无菌操作法将上述处理过的材料剪切成0.5cm的小段，切面接触NA培养基平板，置于37℃培养箱中培养48h。

1.4.2叶片的内生细菌分离

组织分离：取采集新鲜的连翘叶片，用自来水冲洗干净之后带入无菌操作室，用浓度为70%的酒精浸泡3min后，用无菌水冲洗3~4次，用浓度为0.1%的新洁尔灭漂洗3min，再用无菌水冲洗4次.按无菌操作法将上述处理过的材料剪切成0.25cm2的小段，平贴在NA培养基平板上，置于37℃培养箱中培养48h。

研磨法：取采集新鲜的连翘叶片，用自来水冲洗干净之后带入无菌操作室，用浓度为70%的酒精浸泡3min后，用无菌水冲洗3~4次，用浓度为0.1%的新洁尔灭漂洗3min，再用无菌水冲洗4次。将上述材料放进经121℃高压灭菌15min的研钵中研磨，取5滴研磨液加入NA培养基，用三角玻璃刮刀涂布均匀。置于

37℃培养箱中培养48h。

1.4.3 表面消毒效果及检测

在无菌条件下将上述处理过的植物组织用无菌水在培养基上冲洗一次，置于28℃培养箱中培养24h，检查是否还有微生物长出。

1.4.4 内生细菌的分离纯化培养

将培养出的内生细菌，用划线分离法接种在NA培养基上，放入37℃恒温培养箱培养24h。

1.4.5 内生菌的初步鉴定

    对分离纯化后的内生细菌进行革兰氏染色鉴别。

1.4.5 连翘内生细菌的抑菌活性 

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌，进行内生细菌抑菌活性的初步研究。分别刮取培养好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌苔，置于无菌水中，别制成一定浓度的菌悬液（107 CFU/mL）。配制营养琼脂培养基，高压蒸汽灭菌法灭菌。灭菌后待培养基冷却至45-50℃，分别将两种指示菌菌悬液倒入45-50℃的培养基中，混匀后倒平板。

分别将分离得到的连翘内生细菌接种到含有不同指示菌的NA培养基上，37℃恒温培养箱中培养48h。48h后观察接种区域周围是否出现抑菌圈。

2 结果

2.1 内生细菌分离纯化

分离得到5株菌，分别编号为FSL-1、FSL-2、FSL-3、FSS-1、FSS-2。见表1。

表1 连翘内生菌分离纯化的结果

2.2 内生细菌初步鉴定

初步鉴定结果见表2。

表2 五株内生菌的初步鉴定结果

（注：“+”表示革兰氏染色阳性，“-”表示革兰氏染色阴性）

2.3 抑菌活性

实验结果：FSL-2菌株接种到含金黄色葡萄球菌的指示平板上出现明显抑菌圈，表明FSL-2菌株对金黄色葡萄球菌有抑菌作用。

3 讨论

植物内生菌是当前研究较为广泛的一种新型的微生物资源，能够产生十分丰富的生物活性物质，且在抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌及其他方面有较高的活性。本实验从山东协和学院校园内的连翘茎和叶内分离到了五株内生细菌，进行了初步鉴定， 并筛选出了一株对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的菌株。

本次实验在秋季进行，与春季相比不利于内生细菌的生存，故只分离得到五株内生细菌，校园植物有人定期防治病虫害，所得菌株只有一株有抑菌活性或与此有关。未来可以采取不同时期的野生连翘根、茎、叶进行内生菌的分离，并进一步提取其次生代谢产物，来研究连翘对其他微生物的抑制作用机理，让其在医药领域发挥更大价值。

参考文献

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[3]赵红玲,杨晴,王洪凤等.植物类中药材内生菌活性成分资源开发与利用[J].生物资源,2023,45(03):210-217.DOI:10.14188/j.ajsh.2023.03.002.

[4]韩艳珍. 连翘叶质量及清热解毒功效研究[D].河南中医药大学,2022.DOI:10.27119/d.cnki.ghezc.2022.000106.

[5]史正文,郝晶晶,甄会贤等.连翘活性成分及其抗氧化和抑菌性比较分析[J].分子植物育种,2023,21(09):3057-3064.DOI:10.13271/j.mpb.021.003057.

作者：朱亦凡，山东协和学院医学院医学检验技术专业本科学生。

指导教师：崔春晓，山东协和学院，副教授。

基金项目：山东协和学院2023年大学生实验室开放项目（2023SYKF10）。