中脑腹侧被盖区多巴胺系统中神经环路机制的研究

中脑腹侧被盖区多巴胺系统中神经环路机制的研究

张中伟

海南省人民医院 康复医学科

摘要目的：抑郁症是以显著而持久的心境低落为主要临床特征的一种复杂疾病。近年研究证实，中枢神经系统奖赏环路中的腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元和抑郁症的发病机制密切相关，但具体的神经环路连接机制尚不清楚。本实验通过跨单突触病毒颗粒的逆行标记，研究小鼠中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元与外侧下丘脑（LH）是否形成神经环路连接，从而进一步探索LH是否通过 VTA 与 mPFC 还是 NAc 形成单突触神经环路连接。方法：通过立体定位仪将逆向跨单突触病毒颗粒AAV2/5-DIO-TVA-mCherry和AAV2/5-DIO-RG注射到LH脑区，5周后再将SAD△G-EGFP(ENVA)注射到VTA脑区，再等5周取脑采用免疫组化观察VTA与LH脑区是否有单突触投射关系。结果：将病毒定位注入VTA后，可观察到LH内可见荧光的投射纤维。结论：VTA多巴胺神经元的下游可投射到外侧下丘脑，形成单突触投射关系。

关键词：腹侧被盖区；多巴胺；外侧下丘脑；神经环路

抑郁症是以情绪低落为主要外在表现的精神性疾病，据统计，全球有 4.5 亿 人正深受其影响[1]。抑郁症是一种高患病率、高疾病负担、高复发率、高致残率、 高自杀率的慢性精神疾病。WHO 曾报告，预计到 2020 年，抑郁症将成为导致人类死亡和致残的第二大类疾病[2]。抑郁及焦虑障碍每年可导致超过一万亿美元的经济损失。中国抑郁障碍患病率为 4.2%，相关伤残损失健康生命年（YLD）为 8,981,401 人年，占总 YLD 的 7.3% [3]。

探索如何预防、控制、医治抑郁症，已成为当前医疗卫生工作中的重点。抑郁症是一种心理疾病，目前仍然没有特异的生化指标可以诊断；相反在临床抑郁症诊断需要病人自述他们的情绪低落，兴趣减低以及一些次级症状如社会退缩，运动性迟滞等。这些症状的诊断，大部分都需要根据社会环境作为参考。因此抑郁症是一种社会性疾病，其发病因素与个体所处社会环境之间关系较为密切，其中社会应激与社会挫败可能是很重要两个诱因。国外学者长期致力研究控制不同行为的脑神经环路与抑郁症发生发展的机制，本实验讲从中脑腹侧被盖区多巴胺系统中神经环路方面入手，探讨在外界刺激下神经环路是如何协同作用来控制机体应对外界应激。

1、材料和方法：

1.1 实验分组：7 周龄 TH-BAC-Cre 雄性小鼠，自适应 1 周，分为对照组（15 只） 和应激组（30 只），通过对其施加社会失败心理应激并经社会接触实验行为学 评估，将应激群体筛分为易感组和抗压组两组。对照组则模拟社会失败心理应激。

1.2立体定位和病毒颗粒注射：将小鼠用氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物麻醉，置于立体定位仪中，暴露头部，根据脑图谱，确定待注射LH脑区的位置参数（Bregma 向后 2.52mm, 中线往左或往右 0.2mm，Bregma向下9mm）。将病毒颗粒 AAV2/5-DIO-TVA-mCherry和 AAV2/5-DIO-RG 通过微量注射器(5μl 规格)以 0.05μl/min 的速度注射到LH中，逆行标记。5 周后将病毒颗粒 SAD△G-EGFP(ENVA) 以同样方法注射到双侧 VTA 中，逆行标记，等待 5 周制备脑片。

1.3实验模型制备：每天将应激组小鼠作为入侵者，放入长期单独饲养 CD1 小鼠的社交挫败笼（26.7 厘米宽， 48.3 厘米深， 15.2 厘米高）内，进行相互接触 10min。10min 内 TH-BAC-Cre 小鼠将受到 CD1 小鼠攻击并表现出逃跑、恐惧、顺从等从属性特征。10min 的身体接触后，使用清晰透明并且有很多小孔的有机玻璃板将二者隔开进行心理应激 24h，提供更多的感官刺激。在发生 10 次失败后，连续 10 天以上，小鼠在第11天进行了社交接触实验进行测试，由此筛选出易感组和抗压组。待应激组应激结束后，待应激组应激结束后，对照组则使用等当量的鼠笼饲养，２只对照组 TH-BAC-Cre 小鼠成对隔开模拟应激，但不进行身体接触，随后进行单独饲养。

1.4社会接触实验（Social interaction test）： ① 打开软件和摄像头后将实验笼放置到合适的位置，并不断地调整保证充分的视角，最后进行软件的设置。 ② 交互区域内放置一个 10.4cm*6.6cm*18.1cm 的布满小孔的塑料透明小盒，盒内不放入陌生的 CD1 小鼠，然后放入 TH-BAC-Cre 小鼠，然后开始计时，时间设 定为 2.5min，最后得到接触区和非接触区的累积时间，此阶段为 Target absent。 ③ 间隔 30s 后，放入陌生的 CD1 小鼠，然后放入 TH-BAC-Cre 小鼠，然后开始计时，时间设定为 2.5min，最后得到接触区和非接触区的累积时间。 ④ 酒精清洗方箱内壁和底面，擦干后，更换小鼠，继续实验。

1.5 制备急性冠状脑切片：实验鼠断头取脑，振动切片机上制备脑片，每张脑片厚300μｍ，放入人工脑脊液中孵育，在脑片孵育过程中孵育箱内同时充入混合氧气，孵育箱恒温水浴，温度持续监测，温度范围 36～37℃之间。注：人工脑脊液( artificial cerebrospinal fluid，ACSF)：每升溶液中含 NaCl6.779g、KCl 0.402g、MgCl 2·6H2 O 0.183 g、NaH2 PO4 0.14g、NaHCO3 2.201g、CaCl 0.2g，ACSF 预先冲入95%O2 5%CO 2 混和气体。

1.6检测指标及方法 神经电生理检测：将制作好的切片转移到装有人工脑脊液和 95％O2 ·5％CO2 （2.5ml/min）的35℃恒定流速的记录槽中，在全细胞电流嵌模式下记录由病毒颗粒SAD△G-EGFP(ENVA)逆行标记的人工脑脊液脑区中神经元的基础放电水平及可兴奋性，使用Digidata 1440A数字化仪和pClamp 10.2（Axon Instruments）收集数据采集和分析。

1.7统计学处理：所有分析均使用 Prism 软件进行。通过有/无重复因素的方差分 析（ANOVA;多组比较）进行比较，使用双向 t 检验来确定计划比较的统计意义。数据表示为平均值±标准误。统计显着性设定为 p* <0.05。

2.结果

图1慢性社会失败应激（CSDS）后易感小鼠中LH-VTA神经元的兴奋性增加。 （A）从VTA逆行标记的Lumafluor阳性LH细胞（绿色），hypocretin-1（下丘脑分泌素）阳性神经元（红色）和共定位（黄色）的共焦图像。（B）来自CSDS后对照，有弹性和易感小鼠的LH-VTA Lumafluor阳性细胞的细胞附着记录的代表性痕迹。

3. 结论

通过以上的实验研究发现，将病毒定位注入VTA后，可观察到LH内可见荧光的投射纤维，提示VTA多巴胺神经元的下游可投射到外侧下丘脑，形成单突触投射关系。

通过以上实验数据，推测LH可能通过 VTA 与 mPFC 或 NAc 可能形成单突触神经环路联系。是否还有其它脑区与 VTA 有单突触投射关系，以及其它脑区是否与 mPFC 形成环路或 NAc 形成环路还不得而知。因此，我们大胆推测，还有其它脑区与其有单突触投射的潜在联系。具体是哪些脑区，这些脑区神经元放电水平及可兴奋性有何变化规律？需要后续的实验进一步研究。

[参考文献]

[1] Yan, H.C, Cao, X., Das, M, et al. (2010) Behavioral Animal Models of Depression. Neuroscience Bulletin, 26, 327- 337.

[2]Barbw DH.心理障碍临床手册[M]刘兴华,译.３版,北京:中国轻工业出版社,2004:287-354.

[3]Ferrari AJ, Charlson FJ, Norman RE, Patten SB, Freedman G, Murray CJ, Vos T, Whiteford HA. Burden of depressive disorders by country, sex, age, and year: findings from the global burden of disease study 2010. PLoS Medicine 2013; 10: e1001547.

基金资助：海南省人民医院院级青年课题项目（项目编号：QN202019）