基于网络药理学和分子对接探讨刺五加治疗结直肠癌作用机制

基于网络药理学和分子对接探讨刺五加治疗结直肠癌作用机制

仝梓莹  张雅楠  冯文斌  尚亚茹  霍金海通讯作者

黑龙江省中医药科学院  黑龙江省哈尔滨市  150000

摘要: 目的 基于网络药理学和分子对接探讨刺五加治疗结直肠癌作用机制 方法 利用Pubchem数据库和Swiss Target Prediction网络平台进行刺五加作用靶点预测；通过 GeneCards、OMIM、DiGseE 数据库获取治疗结直肠癌靶点蛋白，借助 Cytoscape 3.7.2 软件构建“刺五加-主要活性成分-结直肠癌靶点”网络图，并通过Degree值排名前10筛选核心成分；使用 STRING 平台进行蛋白质相互作用分析；采用 DAVID 数据库对刺五加治疗结直肠癌的作用靶点进行基因富集分析和通路富集分析；使用 AutoDock vina 软件对核心成分与关键靶点进行分子对接验证。 结果 刺五加治疗结直肠癌的主要活性成分为硬脂酸、山奈酚等；预测得到“刺五加-结直肠癌”AKT1、GAPDH、ALB、TNF、CTNNB1，5个关键靶点；基因富集分析得到GO功能条目1329个 (P＜0.05)，包括细胞成分184个、生物学过程695个、分子功能450个；KEGG通路富集得到信号通路195条(P＜0.05)；分子对接验证说明靶点与其成分的结合能较强。 结论 初步研究表明刺五加通过多成分、多靶点、多通路的方式调控和治疗结直肠癌，为研究中药刺五加治疗癌症的作用机制提供了科学依据和参考。

关键词: 刺五加；结直肠癌；靶点预测；网络药理学；分子对接

1.介绍

结直肠癌（CRC）是世界上第四大致命且危害人类生命的常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居前三位，每年导致约90万人死亡[1]。根据中国癌症中心发布的数据，2020年CRC的发病率跃居中国第二位，美国国家综合癌症网络(NCCN)的最新指南表明，结直肠癌的死亡率和发病率均有增高，其治疗存在复发率高、耐受性差、不良反应等问题[2]。

刺五加（Acanthopanax senticosus，AS）是刺五加科植物刺五加的干燥根及根茎或茎。因其抗疲劳、抗炎、抗应激、抗肿瘤和心血管功能等[3]高药用价值而在世界范围内被广泛使用。刺五加能诱导786-O肾癌细胞凋亡，具有抑制肿瘤生长、降低肿瘤、调控蛋白酶依赖性凋亡信号通路的能力[4]。然而，对于刺五加治疗结直肠癌的潜在靶点和作用机制尚不清楚。

本课题组通过采用UPLC-Q/TOF-MS技术推断出黄酮类、皂苷类、苯丙素类、木脂素类、香豆素类、氨基酸类、有机酸类等刺五加208种化合物。在此基础上，本研究基于网络药理学结合分子对接验证方法，确定刺五加治疗结直肠癌的药效物质基础、相关靶点和潜在作用机制，并利用分子对接技术验证其结果，为刺五加的临床应用提供了一定的理论依据。

2.方法
2.1刺五加化学成分与结直肠癌交叉靶点的筛选
本研究将刺五加中化合物成分利用Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对活性成分的SMILE号及2D结构进行检索，利用SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）对刺五加活性成分进行靶点预测和数据整合。利用GeneCards人类基因数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DisGenet（https://www.disgenet.org/）数据库以“CRC、colon cancer、colorectal carcinoma和colorectal cancer”为检索词分别进行检索，设置物种为人，获取疾病靶点基因后合并去重。使用韦恩图制作软件Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ venny/index.html）将所获得刺五加活性成分靶点与结直肠癌靶点之间的靶点进行交集。
2.2构建刺五加活性成分与结直肠癌靶点的PPI网络图
将“刺五加-结直肠癌”的共有靶点通过STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）构建PPI网络图，将生物种类设定为“Homo sapiens”，将STRING数据库得到的TSV文件导入到Cytoscape 3.9.1软件进行可视化结果分析，选取Degree值排名前10的靶点进行可视化处理。分析处理网络拓扑结构参数，明确刺五加治疗结直肠癌的主要活性成分和核心靶点。
2.3 GO功能和KEGG通路富集分析
将刺五加与结直肠癌交集靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行GO分析，包括生物过程（bioogical process, BP）、细胞组分(cell component, CC)富集、分子功能（molecular function, MF），富集条件为PvalueCutoff=0.05且QvalueCutoff=0.05，其余默认原始设置。KEGG通路富集分析，校正P值＜0.05的项目进行筛选，得到富集显著性排名前20条目。并根据每个项目的P值、Q值及富集基因的数目，运用微生信平台对结果进行绘图。

2.4分子对接验证

从PubChem数据库中确定刺五加活性成分的化合物名称、分子量和3D结构，在RCSB PDB数据库（http://www.rcsb.org/）中下载活性成分所对应的3D结构。然后利用AutoDock软件，准备分子对接所需的配体和蛋白质，对于目标蛋白，其晶体结构去除水分子、加氢、修饰氨基酸、优化能量和调整力场参数，利用Discovery Studio分析和观察对接结果。
3.结果

3.1刺五加化学成分与结直肠癌交叉靶点的筛选

对刺五加活性成分进行的靶点预测，去重后共预测到靶点955个。获取疾病靶点基因后合并去重，最终得到疾病靶点29233个。将筛选出的化合物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，如图1所示，刺五加和结直肠癌之间的交集靶点为945个。
 

图1 化合物-疾病共有靶点可视化

3.2  “药物蛋白-疾病蛋白”PPI网络的构建及关键靶点的筛选

将刺五加-结直肠癌的共有靶点分别输入STRING数据库进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens” ，得到 PPI 网络。将所得数据文件分别导入到Cytoscape 3.7.2软件选取Degree值排名前10的靶点进行可视化，如图2所示。将刺五加-结直肠癌蛋白互作网络进行拓扑分析，按照Degree值从高到低将节点进行排序，选取排名前五的靶点作为关键靶点，如表1所示。
           

图2 刺五加-结肠癌蛋白互作分析
 

表1 关键靶点筛选结果

3.3 构建“刺五加活性成分疾病治疗靶点”网络

以刺五加主要活性成分、结直肠癌和共有靶点为基础，构建刺五加-主要活性成分-结直肠癌-靶点网络图，结果如图3所示。同时将网络进行可视化分析，将节点按照Degree值从高到低进行排序，选取排名前五的靶点作为关键化合物，如表2所示。

图3 中药-成分-疾病-靶点网络

表2 关键化合物筛选结果

3.4 生物过程与通路分析

将药物与疾病共有靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8后，通过分析发现，刺五加富集到了1329个GO条目，包括CC 184个，主要定位质膜的组成部分、等离子体膜；BP 695个，主要调控和参与蛋白质磷酸化、肽基-酪氨酸磷酸化等过程；MF 450个，主要表现在跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等方面。选取富集显著性排名前10的富集条目，并根据每个项目的P值、Q值及富集在其上的基因数目，运用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO分析气泡图。横坐标表示靶点数，左边表示BP、CC、MF，颜色表示 P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色，如图4所示。

图4 GO生物过程分析-刺五加

3.5 KEGG通路富集

对药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，将药物疾病共有靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8筛选后，总共富集到195条信号通路。选取富集显著性排名前20的富集条目，并根据每个项目的P值、Q值及富集在其上的基因数目, 运用微生信平台对结果进行可视化分析。横坐标表示富集到基因的数量，左边表示通路名称，颜色表示 P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。主要富集在神经活性配体-受体相互作用等通路，结果如图5所示。

图5  KEGG通路分析-刺五加

3.6分子对接验证

将这5个关键靶点结构5个关键活性成分结构进行分子对接，选取每个靶蛋白对接结合能最佳的化合物5个结果并作图分分析，结果如表3和图6所示。

表3 分子对接结合能

AKT1_hinokinin

ALB_hinokinin

CTNNB1_hinokinin

GAPDH_Quercetin

TNF_Quercetin

图6 分子对接可视化结果

4 讨论

网络药理学结果显示硬脂酸、山奈酚、绿原酸甲酯、槲皮素、荜澄茄内脂5种主要化学成分为刺五加治疗结直肠癌核心成分。结直肠癌疾病靶点中AKT1、GAPDH、ALB、TNF、CTNNB1，5个关键靶点与刺五加核心成分结合活性更高。

5 结论

本研究基于网络药理学方法和分子对接验证，利用相关数据库和软件，科学探索刺五加治疗结直肠癌的核心蛋白靶点和潜在作用机制。结果表明，刺五加对于治疗结直肠癌具有多成分、多靶点的特点，其药物核心成分与疾病关键靶点均可自发结合，且结合能较高，推测刺五加为治疗结直肠癌的有效药物。

参考文献
[1] E. Dekker, P.J. Tanis, J.L.A. Vleugels, P.M. Kasi, M.B. Wallace, Colorectal cancer,Lancet 394 (2019) 1467–1480.

[2] S.I. Grivennikov, F.R. Greten, M. Karin, Immunity, inflammation, and cancer, Cell 140 (2010) 883–899.
[3]梁子涵,王旖瑶,赖逸翔,张靖怡,宋银宏.刺五加提取物及其活性成分免疫调节作用的研究进展[J].中草药,2022,53(15):4895-4904.

[4]王倩,赵刚.刺五加注射液诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡机理的研究[J].公共卫生与预防医学,2013,24(02):13-17.

第一作者：仝梓莹，女，汉 单位：黑龙江省中医药科学院 邮编：150000 籍贯:陕西省宝鸡市 学历：硕士 出生年月：1993年3月 研究方向：中药抗肿瘤 职称：中医执业医师

△通讯作者：霍金海，男，汉 单位：黑龙江省中医药科学院 邮编：150000 学历：博士 出生年月：1981年7月 研究方向：中药分析 职称：研究员