结核实验室痰培养与分子检测

结核实验室痰培养与分子检测

李寒梅

眉山市东坡区疾病预防控制中心  检验科  四川眉山  620000

结核实验室痰培养与分子检测是结核病诊断和监测的重要手段。痰培养，也被称为结核病分枝杆菌分离培养检查法，是结核病病原学诊断的“金标准”。该方法主要分为液态培养和固态培养两种，我国推荐使用罗氏培养基简单法进行培养。此外，分子学检查也是结核病诊断的重要方法。目前，结核病细菌学领域以核酸为基础的分子生物学检测技术进展迅速。以下是关于这两种方法的详细描述：

一、结核实验室痰培养

（1）痰培养的原理：分枝杆菌培养是依据分枝杆菌的生长规律，根据营养和代谢需要的条件，人工营造提供出有利于分枝杆菌生长而抑制其他细菌生长的环境，达到分离出分枝杆菌的目的。常用的固体培养有罗氏、改良罗氏培养基、Middlebrook7H10或7H11；常用的液体液体培养以Middlebrook7H9为基础。

（2）痰培养的过程

2.1痰培养前处理

前处理的步骤：①取1-2ml痰标本至前处理管；②视标本性状加入1-2倍体积的4％氢氧化钠；③震荡30s至标本完全液化；④室温静置15分钟（整个处理时间不得超过20分钟）

前处理方法：①简单法-碱处理法：分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长。②中和离心法：经含NaOH的N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）消化后，磷酸缓冲液（PH6.8）中和后，接种到中心培养基上。

2.2接种

接种的步骤：①准备好两支培养基；②去除培养基中过多的凝固水；③用无菌吸管取前处理后的标本；④接种0.1-0.15 ml（2-3滴）至罗氏培养基斜面；⑤尽量使菌液均匀铺满斜面；⑥每份标本接种2支培养基。

2.3孵育

孵育的步骤：①接种后斜面水平向上，36±1℃孵育24小时；②之后将培养基直立，继续36 ±1 ℃孵育8周（检查瓶盖是否拧紧）；③培养箱温度监测。

2.4结果的观察与报告

①接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况（污染、快速生长分枝杆菌）；②此后每周观察一次，直至满8周（阴性）；③每次观察记录菌落生长及污染情况；④满8周后未见菌落生长，可报告分枝杆菌生长阴性，培养管高压后丢弃；⑤发现显著污染以至无法观察结果，记录“污染”，培养管高压后丢弃；⑥发现疑似分枝杆菌生长，将菌株送上级实验室进行药敏试验

二、分子检测

分子诊断诊断具有检测周期短、检测结果准确可靠的特点。

（1）分子检测的原理：分子检测是通过检测结核分枝杆菌的特异性基因序列来快速、准确地检测结核病的方法。该方法利用了聚合酶链式反应（PCR）技术，将提取的DNA样本进行扩增和检测，以确定是否存在结核分枝杆菌的特异性基因序列。

（2）分子检测的方法：首先需要从样本中提取出DNA，然后利用PCR技术对结核分枝杆菌的特异性基因序列进行扩增。扩增后的DNA片段可以通过荧光或其他方法进行检测，以确定是否存在结核分枝杆菌的特异性基因序列。通过分子检测可以快速、准确地检测出结核分枝杆菌的存在，并且可以判断其耐药性等特征。

（3）分子检测的优缺点：分子检测是一种先进的检测方法，具有快速、敏感、特异性强等优点。它可以对病原体的基因序列进行检测，从而确定病原体种类、耐药性等特征。相比传统的培养法，分子检测可以在数小时内完成检测，大大缩短了检测时间。此外，分子检测可以同时检测多种基因序列，因此可以用于多重病原体的检测，提高了检测效率。但是，分子检测也存在一些挑战和限制。首先，该方法需要专业的设备和技能，只有经过专门培训的专业人员才能操作。其次，分子检测需要严格的实验室质量控制，以确保检测结果的准确性和可靠性。此外，由于PCR技术的灵敏度高，可能会出现假阳性结果，因此需要严格控制实验过程和数据分析。在使用分子检测时，需要结合临床病史和其他检查结果进行综合分析，以避免出现误诊或漏诊的情况。