简易超灵敏快速检测H1N1甲型流感病毒方法的研究

简易超灵敏快速检测H1N1甲型流感病毒方法的研究

张群

山东省淄博市疾病预防控制中心255026

甲型流感病毒，作为一种常见的流感病毒，具有较高的致病率，该病的发生对人类的健康以及社会经济造成了较大的威胁，而且该病具有较强的传染性，通过快速、敏感且具有较强特异性的检测方式可以在疾病的早期发现感染人群，对其传播的途径进行有效的掌握，制定有效的预防措施。当前对于流感病毒的检测可以通过血清学、生物传感器以及病毒核酸检测以及基因芯片技术。但是当前在病毒核酸检测上，检测准确率最高的为PCR技术，但使用该种技术进行检测时，需要的仪器费用高，对人员的操作技术要求高，而使用基于抗原与抗体特异性结合的血清学检测、生物传感器的方法进行检测，其操作具有较高的方便性，操作更为简单，但灵敏度相对欠佳。

【关键词】简易；超灵敏；快速检测；H1N1；甲型流感病毒；

一、核酸的滚环扩增术

  核酸的滚环扩增术作为一种新型的核酸扩增技术，该种检测方式不需要提供昂贵或者复杂的仪器，只要温度处于恒定的状态，便可以进行核酸扩增，该种检测方式更为简单，而且速度快，具有较高的灵敏度，有效的进行了病毒和病原体的检测【1】。核酸适配体作为指数富集配体系统进行技术在体外筛选得到的寡核苷序列，可能和其相应的配体通过高亲和力实现特异性结合。该种情况与抗体进行比较，核酸适配体价格更为低廉，具有较高的合成率，而且稳定性更高。在磁性微球的表面放置核酸适配体进行修复，使得磁球和溶液可以有效的分离，分离的依据为磁场，在操作上更为简单，受到影响的因素更少，同时受到的干扰更少，加上较高的灵敏度，在小分子、蛋白质以及细胞和靶标富集，进行快速的检测，研究生物传感。同时选择微流探芯片SELEX技术进行筛选，得到HIN1 IAV的核酸适配体，之后进行检测，其灵敏度更高。而纳米金溶液颜色的受直径大小的不同，颜色会发生变化，其光学特性和生物相容性较佳。

二、实验的制备

选择HIN1 IAV为靶标，依据磁珠-SELEX技术从ssDNA初级文库筛选候选适配体，通过斑点杂交的方法以及酶联免疫吸附分析方法选择合适的适配体，最终得到两条特异性佳，亲和力高的线状适配体，将得到适配体环化，之后制备环状适配体。行RCA扩增，快速的合成DNA，会与溶液当中的Mg2+反应，形成Mg2P2O7沉淀，继而Mg2+浓度下降。而AuNPs溶液在低盐的状态下其浓度具有较强的稳定性，处于均匀且分散的状态，颜色为酒红色，一旦浓度升高，部分AuNPs就会聚集，溶 液颜色就会发生变化，转为蓝紫色，因此依据AuNPs的颜色变化判断实验的结果【2】。

检测期间就会选择全自动化学发光凝胶成像分析仪；凝胶成像系统；多功能酶标仪；多角度粒度和高灵敏度ZeTa电位分析仪，可见分光光度计。灭活H1N1  IAV、灭活乙型流感病毒，灭活H3N2、灭活H5N1和灭活H7N7病毒；HAuCl4、柠檬酸三钠和浓HNO3；环氧基磁珠；实验室超纯水【3】。

三、实验方法

行H1N1适配体筛选，需要先进行文献的检查，选择磁珠分离法中的ssDNA次级文库进行分离。使用核酸测量仪，分析ssDNA文库的吸光度，计算摩尔比，对次级文库的富集状态是否饱和进行分析，当达到饱和后，筛选结束。对筛选的文库进行克隆，转化入E.coli DH5a感受态细胞。培养后，转化20个转化阳性菌落进行测序，依据测序的结果合成修选适配体，备用。

四、对于斑点杂交法验证适配体

选择室温作为实验的条件，奖3ul 750ng/ul灭活的H1N1 IAV，乙型流感病毒、牛血清白蛋白，滴入到硝酸纤维素膜表面。观察其干燥情况，干燥有效后，将其放置在浓度为10%的BSA溶液当中，时间为2分钟，对NC膜进行封闭，使用结合和洗涤缓冲液对NC膜进行冲洗，数量为3次，将多余的BAS去除。使用链霉亲和素进行孵育，之后再次对NC膜进行冲洗，将ELC显色液加入其中，孵育10s，使用全自动化学发光凝胶成像分析仪对其暴光分析，行斑点杂交实验对适配体进行验证【4】。

五、对ELISA法测定适配体Kd与特异性进行验证

  选择96孔板，每孔中滴入100ul H1N1稀释液，控制温度为4摄氏度孵育，过度，将包被液去除，加入封闭液，时间为2小时，温度为37摄氏度，加入200um B&W缓冲液进行洗板，将多余的BSA去除，加入适量的适配体，设置浓度，室温孵育，设定吸光度【5】。依据为同的靶标进行特异性的验证。

六、小结

选择基于适配体与靶标的特异性识别和富集、新颖的靶标转换成环适配体技术以及以环状适配体为模板的RCA技术，所需的时间更短，而且检测并不需要高精密的仪器，对检测的条件要求更低，在基层和社区可以进行快速的检测，应用前景更佳。

参考文献

[1]李招发,曾静怡,毛雨锐,等.简易超灵敏快速检测H1N1甲型流感病毒方法的研究[J].分析化学, 2022, 50(10):9.

[2]白洁.流感病毒快速检测法在甲型H1N1流感诊断中的应用[J].心血管外科杂志：电子版, 2019(1):2.

[3]王德镔,陈佳琦.血清细胞角蛋白19片段水平在甲型H1N1流感病毒感染诊断中的应用研究[J].中国卫生检验杂志, 2019, 29(1):3.

[4]李多,徐闻,伏晓庆,等.2017年云南省流感病毒监测及甲型H1N1流感病毒血凝素基因特征分析[J].现代预防医学, 2019, 46(10):4.

[5]魏梁.甲型H1N1流感诊断中应用流感病毒快速检测法的效果探讨[J].临床医药文献电子杂志, 2019, v.6;No.403(86):169-169.5