消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的网络药理学机制

消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的网络药理学机制

刘玉雪1，王文萍2，曹莹2，喻明2，孙龙宇1

（1．辽宁中医药大学，辽宁 沈阳，110847; 2．辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳，110032）

[摘要]  目的：运用网络药理学方法探究消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、本草组鉴数据库（HERB）、中医药百科全书数据库（ETCM）及已发表文献，搜索并筛选消瘰丸组方药物的活性成分，利用TCMSP、SwissTargetPrediction平台获取活性成分的潜在靶点；通过GenCards、DrugBank、DisGeNET 数据库检索甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤相关疾病靶点；利用Cytoscape3.9.0构建与分析 “活性成分-靶点”网络；利用韦恩图获取活性成分-疾病共有靶点；借助String11.5平台构建药物疾病共有靶点的蛋白互相作用（PPI）网络; 利用 Metascape 平台对关键靶点进行GO和 KEGG通路富集分析。结果：共获得消瘰丸活性成分14个，相关靶点 139个，与3种疾病共有靶点25个；消瘰丸治疗甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤发挥“异病同治”作用的主要活性成分包括β-谷固醇、茵芋苷、谷氨酸等；药物作用的关键靶点可能为GAPDH、CASP3、BCL2、TNF、PTGS2、CCND1、MMP9、ESR1等；涉及的信号通路包括癌症通路、IL-17信号通路、雌激素信号通路等。结论：本研究基于网络药理学方法从“药物-成分-靶点-通路-疾病”多角度探讨了消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的作用机制，主要涉及炎症反应、免疫调节、雌激素水平变化、细胞增殖、组织增生、血管异位生成等多个过程，从而为后续研究提供数据支持和理论依据。

[关键词]  消瘰丸；网络药理学；甲状腺结节；乳腺结节；子宫肌瘤

[中图分类号]R285；R273

 近年来，随着影像学技术的发展和普及，以及生活节奏的加快，结节类疾病的发病率不断增高，甲状腺结节的超声发现率为18%～67%[1]，乳腺结节的发病率占乳腺疾病的60%～85%，育龄女性子宫肌瘤的发病率达20%～25%[2]，且临床上患者常三种疾病并发。其中甲状腺结节是指甲状腺细胞异常增生后在甲状腺组织中出现的局限性肿块，多与碘摄入、激素水平、放射线和遗传等因素有关，需通过病理检查来判断其良恶性[3]；乳腺结节为超声诊断中对乳腺发现肿物的通称，有良恶性结节之分，多见于乳腺增生、乳腺肿瘤等疾病[4]；而子宫肌瘤属于良性肿瘤，由子宫平滑肌组织增生形成，涉及肌层细胞突变、性激素及局部生长因子间的复杂作用[5]。虽然三者的发病部位、病理因素和临床表现等有所不同，但其存在一定的内在相关性。从西医生理学角度看，甲状腺、乳腺、子宫同为下丘脑-垂体-腺体轴调控下的激素反应性器官，且都存在甲状相关腺激素与雌激素受体，一旦机体内发生内分泌紊乱或雌激素失调，甲状腺、乳腺、子宫组织均可能出现异常增生。另外，从中医角度而言，三者病位同属于肝经循行部位，皆以情志失调、气机失常为主要病因，进而产生气郁、瘀血、痰凝等病理产物，阻于颈前、乳络、胞宫，最终导致肝脾肾脏腑功能失调，发而为病[6]。

消瘰丸出自《医学心悟·卷四·瘰疠》，由蒸元参、蒸浙贝母、醋牡蛎三药研末后炼蜜为丸，古代主要用于治疗“肝经血燥有火，则筋急而生瘰”之瘰疬。其中浙贝母为君，化痰散结、解毒消痈，佐以玄参凉血滋阴、解毒散结，牡蛎化痰软坚，三药合用奏清润化痰、软坚散结之功。现代临床将消瘰丸加味、与他方配伍或中西医治法结合，用于多种甲状腺、乳腺及妇科等多系统疾病的治疗[7]。

网络药理学是系统生物学的重要组成部分，其整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医学的整体观念基本特点相吻合，系统揭示与中医证候相关的整个疾病生物网络及子结构间的相互作用关系，为中医“异病同治”理论提供有力依据[8]。本研究基于网络药理学构建中药、化合物、靶点及疾病之间的网络关系，探究消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤的潜在作用机制，以期为后续实验验证提供思路导向，为疾病的临床治疗提供相关依据。

1  资料与方法

1.1  消瘰丸活性成分筛选及靶点预测 消瘰丸由浙贝母、玄参、牡蛎3味中药组成，在TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）分别搜索其组方药物的化学成分，再根据毒药物动力学（ADME）进行筛选，以口服生物利用度（OB）≥ 30% 、类药性（DL）≥ 0.18 为条件，获得药物活性成分及蛋白质靶点。对于在TCMSP中未搜索到化学成分的中药牡蛎，利用ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM）、HERB数据库（http://herb.ac.cn/）及已发表文献查找其化学成分，通过Pubchem平台获得化学成分的sdf分子结构，再导入SwissADME平台，以胃肠吸收结果为“HIGH”，且五种类药性结果中2个及2个以上是“YES”为标准筛选活性成分，并使用SwissTargetPrediction平台进行靶点预测。之后通过 Uniprot数据库（https://www.uniprot.org）规范靶点名称，最终得到消瘰丸组方药物的相关靶点。

1.2  消瘰丸“活性成分-靶点”网络构建 通过软件Cytoscape3.9.0来构建与分析消瘰丸“活性成分-靶点”网络，其中用“节点”（node）表示成分或靶点，用“边”（edge）表示两者之间的关系；并利用Cytoscape3.9.0软件内置分析工具分析连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closeness）等网络特征参数，以研究消瘰丸中的重要有效成分和靶点及之间的关系。

1.3  疾病相关靶点及共有靶点获取 在GenCards 数据库（https://www. genecards. org）、DrugBank 数据库（https://www. drugbank. com）以及DisGeNET 数 据 库（http://www. disgenet. org）中分别以 “thyroid nodule”、“breast nodule”、“hysteromyoma”（和/或“uterine fibroide”）为关键词获取3种疾病相关靶点。整理3个数据库获得的疾病靶点，再去除重复靶点，并通过韦恩图获取消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤过程中涉及的共有靶点。

1.4  蛋白质相互作用网络构建 应用 String 11.5 平台对“药物－疾病”共同靶点间的相互作用关系进行分析，并设定生物种类为“Homo sapiens”、最小互相作用阈值为“highest confidence(＞0.9) ”，选择隐藏显示网络中的无关联节点，以构建PPI网络。

1.5  通路富集分析 利用Metascape 平台分别对“药物-疾病”共同靶点进行基因本体（GO）生物功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设定其中P＜0.01。另外，运用微生信平台（选取排名前10位的条目绘制成GO生物功能分析柱状图和 KEGG 通路富集分析柱状图）将所得数据结果可视化。

2结果

2.1  消瘰丸活性成分及相关靶点 通过TCMSP 数据库检索和筛选，最终得到活性成分浙贝母7个、玄参9个，相关靶点浙贝母69个、玄参51个；通过 ETCM、HERB数据库及相关文献获得牡蛎化学成分18个，再经Swiss ADME筛选得到活性成分5个，使用SwissTargetPrediction预测得到相关靶点84个。将三味药物活性成分及靶点整合并去除重复后，最终获得消瘰丸活性成分14个，相关靶点 139个。其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）为共有活性成分，见表1。

表1 消瘰丸活性化合物基本信息

注: A代表β-谷甾醇，为浙贝母、玄参共有活性成分

2.2  消瘰丸“活性成分-靶点”网络及分析 利用Cytoscape3.9.0绘制并分析消瘰丸活性成分及其相关靶点的作用关系网络，共计获得156个节点和242条关系，图中节点的大小代表相应的度值，节点面积越大代表度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物学重要性越高，见图1。根据网络节点的连接度和介度等拓扑学性质筛选核心节点进行分析，其中β-谷固醇（beta-sitosterol）连接度为76，介度为0.341911226，预测β-谷甾醇为消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的主要成分，其次为茵芋苷（Skimmin）（连接度为56，介度为0.574271082）、谷氨酸（Glutamic acid）（连接度为33，介度为0.377457203）。以上节点在整个网络中起到枢纽的作用，提示其为该过程中的关键化合物或靶点。

注：图中圆形代表药物；方形代表活性成分；六边形代表活性成分作用靶点

图 1 化合物-靶标网络

2.3  疾病相关靶点及共有靶点 通过在GenCards、DrugBank、DisGeNET 3个数据库检索甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的相关疾病靶点，并去除重复值，分别获得甲状腺结节靶点3010个，乳腺结节靶点3600个，子宫肌瘤靶点1532个，将上述疾病靶点与消瘰丸139个作用靶点取交集并构建韦恩图，最终获得消瘰丸 “异病同治”3种疾病的共有靶点25个，见图2。

图2 消瘰丸成分-甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤靶点韦恩图

2.4  消瘰丸PPI网络的构建与分析 将得到的消瘰丸成分-甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤共同靶点提交至String 11.5平台以构建消瘰丸靶标的PPI网络，见图3。PPI网络中共包含25个节点，155条边。其中节点代表靶标蛋白，边代表各靶标蛋白的相互作用关系。拓扑分析结果显示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和半胱天冬酶-3（CASP3）在网络中的连接度和介度最高（连接度为21，介度为0.084724847），预测为消瘰丸治疗甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的主要靶点。

图3 消瘰丸靶蛋白PPI网络

2.5  靶点功能与通路的富集分析 应用Metascape数据平台对消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的相关靶点进行信号通路分析，由结果可见多个靶点的功能与甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的产生密切相关，这些靶标可通过调控不同的信号通路对三者发挥“异病同治”的作用。消瘰丸主要参与的生物学过程（BP）包括对类固醇激素的反应、对激素的反应、腺形态发生等；细胞组成（CC）主要集中于核被膜、细胞器外膜、转录调节复合体等；相关靶点分子功能（MF）主要集中于雌激素反应元件结合、配体激活的转录因子活性、核受体活性等，见图4。参与的通路主要有癌症通路、血脂与动脉粥样硬化、小细胞肺癌、IL-17信号通路、雌激素信号通路等，见图5。

图4 消瘰丸治疗甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤核心靶点GO生物功能分析图

图5 消瘰丸治疗甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤核心靶点KEGG通路富集分析图

3讨论

有临床研究发现，子宫肌瘤患者常常伴发乳腺结节和或甲状腺结节，其发病率显著高于子宫正常患者[2]，这常常引发患者的焦虑情绪，严重影响患者生活质量。目前西医治疗主要针对其中某一疾病，以定期随访、调节激素及手术治疗为主。而中医则基于“异病同治”理论，联系经络循行特点，整体把握病因病机，调节多发结节体质。消瘰丸有清润化痰、软坚散结之功，现代药理研究表明，消瘰丸组方中玄参、浙贝母、牡蛎三药分别具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及调节血液循环系统的作用，可以有效的运用于炎症、增生及肿瘤等相关疾病[9]。故本研究采用网络药理学方法，进一步对消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的潜在作用机制进行探讨。

3.1  主要活性成分分析 根据图1拓扑分析结果推测，在消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤中起主要作用的成分可能为β-谷固醇、茵芋苷、谷氨酸等。其中β-谷甾醇可调控PTGS2、NCOA2、HSP90AA1、PGR、ADRB2、SCN5A等靶点，而这些靶点与其他活性成分之间也存在互相作用，体现出消瘰丸多种活性成分的协同作用机制。已有研究表明，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等药理作用[10]。林明珠等[11]研究发现β-谷甾醇可通过调控H22荷瘤小鼠模型中IL-6、IFN-γ、VEGF的表达抑制肿瘤生长。另外，β-谷甾醇可与雌激素受体结合发挥雌激素样作用[12]，以抑制甲状腺、乳腺、子宫等腺体组织的异常病变。药理研究表明，茵芋苷具有抗肿瘤和神经保护等活性[13]。谷氨酸及其受体也可作用于肿瘤微环境，调节抗肿瘤免疫反应[14]，对于甲状腺、乳腺恶性结节起到较好的抑制作用。

3.2  关键靶点结果分析 利用PPI网络分析消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的25个共有作用靶点，获得GAPDH、CASP3、BCL2、TNF、PTGS2、CCND1、MMP9、ESR1等关键作用靶点。其中GAPDH是一种多功能蛋白酶，可通过延长mRNA半衰期而调节蛋白表达调控肿瘤细胞生长[12]。而CASP3是一种在细胞凋亡中发挥核心作用的蛋白酶，能够调控肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力[15]。赵若晗等[16]研究发现，通过CENPT、P53、Bax、CASP3信号通路可调节细胞凋亡影响乳腺癌进展。此外，Bcl-2 家族是在细胞凋亡信号转导途径中起重要作用的调控蛋白[17]。临床研究发现，bcl-2在子宫肌瘤中的表达存在周期性差异，分泌期明显强于增生期，提示 bcl-2的表达可能受性激素的调节[18]。ESR1 作为主要的雌激素受体，主要表达在子宫、卵巢、乳腺、前列腺等器官中，而其表达量异常可提示组织发生异常增生[19]。以上研究表明，消瘰丸可能通过影响上述多个关键靶点的表达，对甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤三者存在的相关病理机制起到调治作用。

3.3  通路与生物进程分析 结合GO 和 KEGG 富集分析结果及文献研究发现，消瘰丸发挥“异病同治”作用涉及对激素的反应、腺形态发生、腺发育等生物学过程，与癌症、IL-17、雌激素等信号通路关系较密切，参与肿瘤、免疫调节、炎症反应、雌激素等多个环节。IL-17是由T辅助细胞17( Th17) 分泌的重要促炎因子。IL-17 与受体结合后通过信号转导激活下游NF-κB、JNK/ STAT、PI3K/Akt 、MAPK等信号通路，参与炎症反应、自身免疫疾病和肿瘤的发生发展

[20]。而慢性炎症的进展会引起组织增生，进而促进肿瘤新生血管生成，这与甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的发病机制密切相关。雌激素通过结合细胞内多种雌激素受体调节细胞功能，有研究发现，雌激素亦可与G-蛋白偶联受体（GPR30）结合激活 PI3K、MAPK 信号通路，促进内皮细胞增殖和转移[21]。根据以上研究推测，消瘰丸通过调控相应信号通路上细胞增殖、凋亡、迁移、异位血管生成等生物学特性，发挥治疗甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的作用。

综上所述，本研究基于网络药理学方法从“药物-成分-靶点-通路-疾病”多角度探讨了消瘰丸“异病同治”甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的作用机制，主要涉及炎症反应、免疫调节、雌激素水平变化、细胞增殖、组织增生、血管异位生成等多个过程，为后续研究提供了数据支持和理论依据。 但目前本研究仅在理论上进行了分析预测，且相关数据库信息还存在局限性，故所得结论有待后续动物及临床试验进一步验证。

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基金项目：1.辽宁省中医大师(辽宁省名中医)传承工作室建设项目(辽中医药综合字[2021]32 号)；2.国家中医药管理局中药临床药理学科建设项目（20121010）；3.基于MEK-ERK 通路探讨四逆散合酸枣仁汤治疗肿瘤相关性失眠的机制研究

第一作者：刘玉雪，女，2021级硕士研究生，研究方向：中西医结合肿瘤研究

通讯作者：王文萍，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中西医结合肿瘤防治