CD66a对急性髓系白血病骨髓细胞增殖的影响研究

CD66a对急性髓系白血病骨髓细胞增殖的影响研究

戴永刚

山东省立第三医院   250031

摘要:

 背景：白血病是一类严重威胁生命的恶性血液疾病，其中急性髓系白血病（AML）是其中最为常见的类型。CD66a又称为CEACAM1，主要存在与血液有核细胞表面，是一细胞粘附蛋白,能促进细胞增殖，抑制AML细胞凋亡。

方法：我们收集了经FAB、免疫学、基因检测等确诊的AML患者的骨髓细胞作为研究对象，对照组为正常骨髓或者良性血液病（如贫血）标本，分离骨髓有核细胞的并筛选，转入CD66a的siRNA质粒，验证转染效率并用MTT法检测骨髓细胞的增殖情况。

结果：在48h、72h、96h时间点，siRNA-CD66a组的增殖活性都明低对照组，在48h两者没有用差别。这些结果表明，下调AML-3细胞的CD66a的mRNA可抑制其细胞增殖。

结论：本研究表明CD66α在AML骨髓细胞增殖中有重要的作用，也为今后研究CD66α与AML发生发展的机制打下了研究基础。

关键词：CD66α   AML    细胞增殖

引言

白血病是一种严重的血液和骨髓恶性疾病，对生命构成威胁。在我国，儿童和35岁以下的成年人因恶性肿瘤导致的死亡率最高，严重影响了青少年的身心健康。急性白血病比慢性白血病更为常见，其中最常见的是急性髓细胞白血病（AML）。这种侵袭性血液恶性肿瘤的特征是细胞无节制的增殖、分化障碍和凋亡受阻，使细胞停留在不同的发展阶段。大多数患者的预后很差。AML的临床表现包括感染、贫血、胸骨下端的局部压痛、肝脾肿大、淋巴结肿大和髓外组织器官浸润等。病情发展迅速，自然病程只有数周至数月。AML的发生与物理因素、化学因素、遗传因素、生物因素以及其他血液病因素都有关联。除此之外，最近的研究还发现基因的改变也是导致白血病发生的重要因素。例如，CD66α（CEA Cell Adhesion Molecule 1，CEACAM1）基因的改变与白血病的发生密切相关。

白血病是一组威胁生命的血液和骨髓恶性疾病[1]｡在我国恶性肿瘤所致的死亡率中,儿童及35岁以下成人位居首位,因此严重威胁着我国青少年及儿童生理及心理健康｡我国急性白血病比慢性白血病多见｡其中,急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)最为常见[2]。它是一种侵袭性血液学恶性肿瘤,因细胞增殖失控,分化障碍,调往受阻而停滞在细胞发育的不同阶段,并且多数患者的预后很差[3]｡AML临床以感染,贫血,胸骨下端的局部压痛,肝脾肿大,淋巴结肿大,髓外组织器官浸润为主要表现,病情进展迅速,自然病程仅有数周至数月[4]｡AML的发生与物理因素,化学因素,遗传因素,生物因素及其他血液病因素密切相关｡除上述因素之外,越来越多的研究发现某些编码基因的改变成为诱发白血病发生的重要因素｡CD66α（CEA Cell Adhesion Molecule 1，CEACAM1）是一种具有编码功能的结构蛋白。作为细胞粘附蛋白，它主要存在于血液有核细胞中[5]。CD66α在组织三维结构的分化和排列、血管生成、细胞凋亡、肿瘤抑制、转移以及先天和适应性免疫应答的调节中发挥重要作用。自然杀伤（NK）细胞激活后，通过与CEACAM1在靶细胞上的反亲相互作用，抑制KLRK1介导的带有CEACAM1的肿瘤细胞的细胞溶解[6-8]。此外，有研究报道CD66α的异常表达可以促进人白血病B细胞的增殖并抑制其凋亡[9-10]。尽管CD66α与某些生物学过程有关，但关于AML与CD66α之间关系，尤其是与细胞增殖方面的深入研究仍较少，这值得我们进一步探讨。

1、材料与方法

1.1一般资料

本研究收集了5例骨髓标本，这些标本来自2021年1月至2021年12月期间首次被诊断为AML的儿童和成人。这些样本都采用了EDTA抗凝处理。采用了形态学、流式细胞术免疫表型诊断和基因检测来对每个样本进行诊断和分类。根据FAB分类法，均为M4-M5。年龄最小6岁，最大的78岁。谱系归属和亚型的免疫学标准是根据EGIL推荐标准应用的[11]。对照组采用了正常骨髓或者良性非增殖类疾病（如贫血）的骨髓标本。本实验经过了山东大学附属省立第三医院伦理委员会的批准。｡

1.2 仪器与试剂

骨髓有核细胞的分离及纯化采用骨髓有核细胞分离液配合低速离心进行分离；提取骨髓总RNA使用Trizol试剂；RT-qPCR使用的是罗氏LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪器及其配套试剂，使用的引物如下表1所示。

表1 实验所用引物一览表

1.3 骨髓有核细胞的分离及纯化

将临床项目检测完毕的，在无菌条件下抽取的EDTA抗凝骨骨髓与PBS溶液按1：1比例混匀，备用。按照骨髓细胞：分离液比例为3:2的比例，缓慢将稀释骨髓液加入到细胞分离液上层，需保持液面分界清晰。800g，室温离心 25min。离心结束后，管内液面从上至下依次为无细胞骨髓液层、骨髓单个核细胞层、分离液层和红细胞层。小心吸取骨髓单个核细胞层（即白膜层）并转移至15mL离心管中。向离心管中加入10mL 的生理盐水或PBS重悬细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，得到纯化的骨髓有核细胞。

1.4 细胞培养及筛选

骨髓有核细胞悬液，加入 20ml 离心管内，配平后放入离心机，3000 rpm 离心 8 min。弃掉上清液，加入 2ml 培养液，用移液管吹打细胞制成细胞悬液。取 20 ul 细胞悬液滴入细胞计数器，计算细 胞浓度。向细胞悬液内加入细胞培养液，至细胞浓度约为 5 x 104。之后将细胞接种于 24 孔 板内，放置在细胞培养箱（37.5℃，5%CO2）内常规培养。每 72 小时全量更换细胞培养液。

1.5 siRNA-CD66a 序列转染

转染前 24 更换培养，转染前 2 h 将细胞培养基更换为基础培养基。 无菌离心管中加入质粒和 RNA，与相应体积的 Opti-MEM 混合均匀，在室温下温育。Lipofectamine 2000 摇匀后取 50μl 在另一管中与 0.95 ml Opti-MEM 混合稀释，在室温下温育 5 min。 稀释后的 DNA 与 Lipofectamine 2000 进行混合，轻轻地颠倒混匀，控制在 5 min之内。室温温育 20 min，充分形成siRNA-CD66a 与 Lipofectamine 2000 的转染复合物。将转染混合液转移至细胞的培养液中，混匀，于 37℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。 8. 8 h 后吸去混合培养基，每皿加入 10 ml 的 PBS 液，轻轻晃动洗涤残余混和物，吸掉上清。每瓶细胞中加入培养基 10ml，于 37℃、5%CO2培养箱内继续培养。

1.4 骨髓RNA的提取

将骨髓有核细胞混匀,吸取悬液200ul和Trizol试剂1ml,反复吹打,放置室温20min｡加入200-300ul 4℃氯仿,混匀后室温放置5min｡ 4℃,15000rpm,离心10-15min｡吸取上清,加入0.6倍体积-20℃异丙醇,混匀后-20℃放置30min｡4℃,15000rpm,离心10-15min,去上清后加入-20℃的75%DEPC乙醇1ml洗涤,在4℃,15000rpm,离心10-15min,去上清让RNA沉淀在室温自然晾干,加入30-50ulDEPC水溶解,用260/280检测RNA的纯度｡纯度1.800-2.000,浓度200-500ng/ul｡

1.5  RT-qPCR

将RNA2ug、逆转录酶10ul，无酶水适量，构建40ul反应体系，55℃下逆转录15min；然后将反应体系稀释2-5倍，将其稀释使GAPDH内参基因Ct值在18-28范围内。将10ul逆转产物，10ulSYBR Green混合液、1uM上下游引物、适量无酶水构成20ul体系，使用实时荧光定量PCR仪,按照以下程序进行qPCR反应：95℃，2min→（95℃，10sec+60℃，30sec）×40循环→熔炼曲线分析，其中60℃末尾收集FAM荧光。每个因子重复三孔取Ct平均值，减去GAPDH，得到ΔCt以及2–ΔΔCT并做图。

1.6 MTT 增殖实验

取 5 块 96 孔板，分别标记好 d1~d5，划分上下左右为四个区域，每个区域分三组细胞：CON、NC、KD，每组细胞 5 个副孔。准备好血球计数板；将处于对数期细胞消化后，4.5 1500 rpm 离心 3 min，去掉上清，沉淀用培养基重悬，制成细胞悬液；吸取 10uL 细胞悬液，沿盖玻片一边缓慢加入细胞悬液，进行细胞计数；按照 2000cell/well进行铺板。在孔板周围一圈加入适量 PBS，放置培养板中细胞液被烘干。放进细胞培养箱中培养；细胞贴壁后，取出标记 d1 的 96 孔板，每孔加入 20μl 5mg/ml 的 MTT，轻轻震荡混匀；反应 4 h 后，每孔加入 100μl 酸化异丙醇终止反应，震荡混匀；放入培养箱孵育反应至少 4h，用酶标仪 595nm 检测 OD 值。

1.6 统计方法

采用GraphPad Prism 9软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x ̅±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验； P＜0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 9软件绘制图制表。

3、结果

3.1 AML细胞系的筛选

      我们将获取的PBMC通过体外细胞培养，分离出了5例AML骨髓原代细胞系，标记为AML-1至5，分别检测其CD66a的mRNA相对表达量（GAPDH作为内参），结果如图1所示：5组实验组的CD66a的mRNA相对表达量均高于对照组，其中AML-3的表达量最高，我们将其作为后续的研究对象。

图1  AML细胞系的筛选

3.2 siRNA-CD66a的转染效率

为了进一步探CD66a对AML骨髓细胞活性和功能的影响，我们在结果3.1中筛选的AML-3细胞中构建了沉默CD66a的细胞系。我们用q-PCR验证了该细胞系的转染效率,结果证实转染成功(p<0.0001，图2)。

图2  siRNA-CD66a的转染效率

3.2 MTT 法检测AML-3细胞的增殖活性

在此基础上，我们用 MTT 法检测了两组AML-3细胞的增殖活性。结果显示，在48h、72h、96h时间点，siRNA-CD66a组的增殖活性都明低对照组（图3及表2)。但在48h两者没有用差别。这些结果表明，下调AML-3细胞的CD66a的mRNA可抑制其细胞增殖。

图3  MTT 法检测AML-3细胞的增殖活性

表2   下调CD66a后AML-3细胞的不同时间点的增殖活性比较

4、讨论

CD66α是具有编码功能的结构蛋白。作为细胞粘附蛋白，它主要存在于白细胞，上皮和内皮上。其编码的蛋白以钙非依赖方式与亚组其他蛋白的同种和异种结合介导细胞粘附。多种细胞活性已经归因于其编码的蛋白质，包括在组织三维结构的分化和排列，血管生成，细胞凋亡，肿瘤抑制，转移以及先天和适应性免疫应答的调节中的作用[12]。经过本研究的实验，我们发现下调AML-3细胞的CD66a的mRNA可抑制其细胞增殖，说明CD66α的表达与AML-3的增殖有很大的相关性，这也符合CD66α的生理作用[13]。下一步，我们将继续研究CD66α在AML中的作用及机制，本研究为下一步的研究奠定了坚实的基础。

参考文献

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