葛根枳椇子提取物毒理学安全性评价

葛根枳椇子提取物毒理学安全性评价

李泽英 何涛 姜欣

浙江医学高等专科学校 浙江宁波 315100

【摘要】目的 对葛根枳椇子提取物毒理学安全性评价。方法 采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验，致畸试验。结果 在本试验条件下，葛根枳椇子提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于15000mg/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；葛根枳椇子提取物以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围内；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。葛根枳椇子提取物未见致畸作用。结论 葛根枳椇子提取物长期食用是安全的。

【关键词】枳椇子、急性经口毒性、遗传毒性、90天经口毒性、致畸、安全性

葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 的干燥根[[1]]，葛根素是葛根的主要有效成分之一，具有降低肾上腺素、四氧嘧啶和链脲佐霉素引起的血糖升高[[2]]，并具有清除体内自由基、保护细胞免受自由基损害的作用[[3]]。枳椇子为鼠李科植物枳椇的干燥成熟种子。主要产于陕西、广东、湖北、浙江、江苏等地[[4]]。枳椇子为民间常用的解酒毒、除烦、止渴、止呃、利二便的中药，用于治疗酒醉、烦热、口渴、呕吐、二便不利等症，泡酒服之亦能舒筋络[[5]]。本试验旨在对葛根枳椇子提取物进行安全性毒理学试验研究。

1试验材料

1.1受试物 葛根枳椇子提取物，由葛根提取物和枳椇子提取物混合制成。葛根提取物经提取（10倍量50%乙醇80℃回流提取2h，8倍量50%乙醇80℃回流提取2h）、过滤、浓缩、干燥等主要工艺加工制，提取比例约10:1，测得葛根素含量为15.2%。枳椇子提取物经提取（50%乙醇80℃回流提取，6倍量提取3h，4倍量提取2次，每次2h）、过滤、浓缩、干燥等主要工艺加工制成，提取比例约10:1，测得总黄酮含量为4.5%。葛根枳椇子提取物人体推荐剂量为1.0g/人/d，其中葛根提取物0.65g、枳椇子提取物0.35g。

1.2实验动物 急毒：健康成年SPF级SD大鼠20只，体重180～220g，雌雄各半。三项遗传毒性试验：SPF级ICR小鼠，体重25～35g。90d经口毒性试验：SPF级健康离乳SD大鼠，体重50～100g，雌雄各半。致畸：性成熟雄性和雌性动物1:2比例合笼交配，如5d内未交配，更换雄鼠。

2 试验方法

2.1急性经口毒性试验：依据GB 15193.3进行试验，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

2.2 细菌回复突变试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法，证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿和8μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，首次试验将高剂量组用纯化水按一定比例逐级稀释配制成10、2、0.4、0.08mg/mL4个剂量组，验证试验将高剂量组用纯化水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。

2.3 哺乳动物红细胞微核试验：选用SPF级昆明种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的50、100、200倍即0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw给予，同时设溶剂对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，在有代谢活化的条件下选择1250µg/mL、625µg/mL、312µg/mL，在无代谢活化的条件下选择78、156、312µg/mL，进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为20μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

2.5 90天经口毒性试验：动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的50、100、200倍即0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

2.6 致畸试验：对受孕SD大鼠于受孕第6～15天每天经口给予0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw剂量的葛根枳椇子提取物，另设一个溶剂对照组0g/kg.bw，于孕第20天处死孕鼠，解剖观察孕鼠胚胎毒性指标及胎鼠生长发育指标。

3 结果

3.1 大鼠急性经口毒性试验：在本试验条件下，雌、雄大鼠剂急性经口毒性试验的LD50均大于15000mg/kg.bw。根据急性毒性剂量分级标准，将其判定为实际无毒级物质。

表1 急性毒性试验结果(±s)

3.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

3.3  90天经口毒性试验：葛根枳椇子提取物以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。

表2 葛根枳椇子提取物对大鼠血液生化学指标的影响（n=10）(±s)

表2续 葛根枳椇子提取物对大鼠血液生化学指标的影响（n=10）(±s)

3.4 致畸试验：葛根枳椇子提取物0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw组孕鼠体重、体重增重、胚胎发育、外观畸胎率、骨骼畸胎率、内脏畸胎率及总畸胎率与0g/kg·bw/d组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。根据《食品安全国家标准 致畸试验》GB 15193.14—2015判定，在本实验条件下，葛根枳椇子提取物的母体毒性未观察到有害作用剂量（NOAEL）为3.33g/kg·bw/d；葛根枳椇子提取物未见致畸作用，NOAEL为3.33g/kg·bw/d。

4结论根据GB 15193.1-2014 食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序，本研究针对葛根枳椇子提取物长期食用安全性进行了研究，采用限量法，在本试验条件下葛根枳椇子提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于15000mg/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；葛根枳椇子提取物以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。葛根枳椇子提取物以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw的剂量进行致畸试验，结果葛根枳椇子提取物未见致畸作用。本研究为葛根枳椇子提取物应用于保健食品提供了安全性依据。

参考文献

[[1]] 中华人民共和国药典.

[[2]] 林毅，张若楠.葛根素研究概况[J].黑龙江中医药，2000,4:56-58.

[[3]] 朱庆磊，何爱霞，吕欣然.葛根素对氧自由基的清除和抗氧化性损伤作用[J].解放军药学学报，2001,17（1）：1-4.

[[4]] 天津市中药饮片炮制规范.2018年版

[[5]] 谢立，陈振德，等.枳椇子解酒活动提取部位的研究.中国药房，2007,18（33）：2570-2572