桑叶玉米须提取物安全性毒理学实验研究

桑叶玉米须提取物安全性毒理学实验研究

韩玲 韩建斌 张欢欢

菏泽医学专科学校  山东菏泽  274000

摘要目的 研究桑叶玉米须提取物的急毒、遗传毒性、90d经口毒性。方法 参照GB 15193系列食品安全国家标准开展试验内容。结果 桑叶玉米须提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于12.0g/kg·bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；本试验桑叶玉米须提取物以1.00g/kg·bw、2.00g/kg·bw、4.00g/kg·bw的剂量给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，试验结束时雌雄大鼠体重、总增重、总摄食量及总食物利用率与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。结论在本实验条件下，桑叶玉米须提取物无急性毒性、遗传毒性、亚慢性毒性。为桑叶玉米须提取物应用于保健食品原料安全性提供了依据。

关键词：桑叶玉米须提取物；90d喂养；致畸

桑叶为桑科植物桑(morus alba L.)的干燥叶，味甘、苦，性寒，归肺、肝经；具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效。用于风热感冒、肺热燥 咳、头昏头痛、赤昏花[[1]]。桑叶中黄酮类成分具有抗氧化、降血糖、降血脂和抑制动脉粥样硬化等多种药理作用[[2]]。现代药理研究证明，桑叶中功效成分具有降血压、抑制血糖上升、抗菌、消炎、改善血脂、延缓衰老和抗肿瘤、抗氧化等功效[[3]]，具有良好的药用价值。玉米须为传统中药，是禾本科玉蜀黍的花柱和柱头，是玉米花粉的雄花。现代药理学研究表明，玉米须具有利尿排石、降血糖、降血压、抗炎、抗肿瘤、抑菌、增强免疫力等作用[[4]]。本研究通过动物实验，连续灌胃SD大鼠90天桑叶玉米须提取物，观察桑叶玉米须提取物连续灌胃对大鼠的长期毒性，评价桑叶玉米须提取物长期服用的安全性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1受试物：桑叶玉米须提取物为棕黄色粉末，人体推荐量为1.2g/人/d，其中桑叶提取物0.3g，玉米须提取物0.9g。

桑叶提取物制备方法：经提取（6倍量60%乙醇80℃左右提取3h，4倍量60%乙醇80℃左右提取2次，每次2h）、过滤、浓缩、干燥制得，测得总黄酮含量1.3%。

玉米须提取物制备方法：经提取（8倍量60%乙醇80℃左右提取3h，6倍量60%乙醇80℃左右提取2次，每次2h）、过滤、浓缩、干燥制得，经测定总黄酮含量5.6%。

1.1.2实验动物：健康成年SPF级SD大鼠，雌雄各半；SPF级健康离乳SD大鼠，雌雄各半，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；清洁级ICR小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用体重为180-220g的SPF级SD大鼠20只，雌雄各半。按最大灌胃量（20mL/kg.bw）,一日内3次给样，每次间隔4h，受试物给予剂量为12.0g/kg·bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

1.2.2 细菌回复突变试验：按GB 15193.4—2014 食品安全国家标准 细菌回复突变试验要求，采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法、证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。

1.2.3 哺乳动物红细胞微核试验：按GB 15193.5—2014 食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验要求，选用体重25～35 g ICR种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按1.00、2.00和4.00g/kg·BW给予，同时设溶剂对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

1.2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：按GB 15193.23—2014 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验要求，选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为20μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9 mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

1.2.5 90天经口毒性试验：按GB 15193.13—2015 食品安全国家标准90天经口毒性试验要求，选用体重80±5gSPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各半，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的50、100、200倍即1.00、2.00和4.00g/kg·BW给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。 计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。 测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

1.3数据处理：采用SPSS11.0统计软件对数据分别进行One-way ANOVA分析及Dunnett检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1 大鼠急性经口毒性试验

在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠桑叶玉米须提取物急性经口毒性试验LD50＞12.0g/kg·bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。

2.2细菌回复突变试验结果

首次试验和证实试验显示：有代谢活化和无代谢活化的情况下，受试样品各剂量组均未观察到沉淀，各剂量组亦未观察到受试样品对测试菌株产生明显毒性。受试样品各剂量组测试菌株TA98、TA1535的回变菌落数均小于未处理对照组的2倍，其他测试菌株的回变菌落数小于未处理对照组的2倍，亦无剂量-反应关系。因此桑叶玉米须提取物在加与不加S9情况下，细菌回复突变试验结果均为阴性。

表1 细菌回复突变试验回变菌落数计数结果 （首次试验，平板掺入法）

a：不加S9时，TA97,TA98菌株阳性对照为2,4,7-三硝基芴酮0.2μg/皿，TA100、TA102为甲基磺酸甲酯1.0μL/皿，TA105为叠氮钠1.5μg/皿；加S9时，TA97,TA98，TA100和TA105菌株阳性对照为2-氨基芴10.0μg/皿，TA102为1,8-二羟基蒽醌50.0μg/皿。与溶剂对照组比较，**P＜0.01。

2.3哺乳动物红细胞微核试验

由下表可见，受试样品的各剂量组微核率与阴性对照组比较无显著性差异（P＞0.05），而阳性对照组高于阴性对照组，有显著性差异（P＜0.05）。受试物各剂量组的嗜多染红细胞与总红细胞比值与对照组的差异均在对照组20%以内，受试物对骨髓细胞增殖没有抑制作用。未见桑叶玉米须提取物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成及嗜多染红细胞与总红细胞比值产生影响，因此桑叶玉米须提取物哺乳动物红细胞微核试验结果为阴性。

表2受试样品对小鼠骨髓细胞微核发生率和嗜多染红细胞与总红细胞比值的影响（±s，n=5）

与溶剂对照组比较，**P＜0.01

2.4体外哺乳类细胞染色体畸变试验

在无代谢活化处理3小时条件下，受试样品各剂量组的细胞染色体畸变率均低于5%，与溶剂对照组相比，各剂量组未发生染色体畸变率显著增加（P＞0.05）。与溶剂对照组相比，阳性对照组（丝裂霉素）染色体结构畸变率在统计学上具有显著增加（P＜0.05）。在代谢活化条件下，受试样品各剂量组的细胞染色体畸变率均低于5%，与溶剂对照组相比，各剂量组未发生染色体畸变率显著增加（P＞0.05）。与溶剂对照组相比，阳性对照组（环磷酰胺）染色体结构畸变率在统计学上具有显著增加（P＜0.05）。因此桑叶玉米须提取物体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果为阴性。

2.5 90天经口毒性试验：

2.5.1 一般情况观察  各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。

2.5.2对大鼠体重、增重及食物利用率的影响以1.00g/kg·bw、2.00g/kg·bw 和4.00g/kg·bw 三个剂量的桑叶玉米须提取物经灌胃给予大鼠，连续90天。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P＞0.05）。90天喂养结束时，与阴性对照组相比各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P＞0.05）。结果见表3,4。

表3  桑叶玉米须提取物对大鼠体重的影响（，n=10）

表4  桑叶玉米须提取物对大鼠总摄食量、食物利用率的影响（，n=10）

2.5.3眼部检查

在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化。

2.5.4大鼠尿常规指标

经口给予大鼠不同剂量的桑叶玉米须提取物90天，测定大鼠尿常规指标。结果各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P＞0.05）。

2.5.5大鼠血液学指标

经口给予大鼠不同剂量的桑叶玉米须提取物90天，测定各剂量组大鼠血液红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞计数及其分类等指标、红细胞压积、血小板计数等指标。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P＞0.05），结果见表5。

表5桑叶玉米须提取物对大鼠血液学指标的影响(±s)（n=10）

2.5.6大鼠血液生化指标

经口给予大鼠不同剂量的桑叶玉米须提取物90天，测定各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P＞0.05），结果见表6。

表6 桑叶玉米须提取物对大鼠血液生化指标的影响(±s)（n=10）

2.5.7大体病理及组织学检查

经口给予大鼠不同剂量的桑叶玉米须提取物90天，测定各组大鼠心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、卵巢绝对重量及相对重量（脏/体）。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P＞0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

3结论

黄酮类化合物具有广阔的应用前景，本研究针对桑叶玉米须提取物急性毒性、遗传毒性、长期食用安全性进行了研究，为桑叶玉米须提取物应用于保健食品原料安全性提供了依据。

参考文献

[[1]] 中华人民共和国药典[S].北京.化学工业出版社.

[[2]] 贺伟强.桑叶黄酮的提取工艺及药理功效研究进展[J].北方园艺，2012：21（1）：181-183.

[[3]] 卢建峰，闫学红.桑叶降血糖作用研究[J].中国现代医生，2009,47（13）：80-81.

[[4]] 马天成，孙宇，刘雷.玉米须黄酮类成分提取工艺及抗氧化活性物质基础研究.中国现代应用药学.2019，36（22）：2794-2799