山药乌梅知母提取物混合粉毒理学试验评价

 山药乌梅知母提取物混合粉毒理学试验评价

吴浩杨惠孙海燕

潍坊护理职业学院 山东潍坊 262500

【摘要】目的进行山药乌梅知母提取物混合粉毒理学安全性评价。方法 采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验，致畸试验。结果 在本试验条件下，山药乌梅知母提取物混合粉雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；山药乌梅知母提取物混合粉以3.33g/kg.bw、6.67g/kg.bw、10.00g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围内；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。山药乌梅知母提取物混合粉对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性。结论 山药乌梅知母提取物混合粉长期食用是安全的。

【关键词】山药；乌梅；知母；毒理学

很多中药材具有药食同源的特殊属性，即可为药材入药治病，亦可作食物滋补养身，山药、乌梅均为药食同源。研究发现，山药中存在丰富的微量元素，还有粘蛋白以及维生素等，这些物质可以有效防止心血管系统发生脂肪沉积，从而使血管保持弹性。而且山药当中存在的多巴胺可以扩张血管，从而改善血液循环[1]。始载于《神农本草经》,列为中品。在历代本草中均划属收涩药,性平,味酸涩,归肝、脾、肺、大肠经,具有敛肺涩肠、生津止渴、驱虫止痢的功效［2］。知母始载于《神农本草经》，为常用中药，具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等功效，有着重要的药用价值。知母根茎中含有大量甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类、大量黏液质及微量元素等[3]。本文旨在对山药提取物、乌梅提取物、知母提取物混合制得的混合粉进行毒理学试验评价。

1试验材料

1.1试验药物

1.1.1山药提取物，山药经65%乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得山药提取物，薯蓣皂素4%，提取得率约10%。

1.1.2乌梅提取物，乌梅经8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得乌梅提取物，提取率约10%。

1.1.3知母提取物，知母经60%乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得知母提取物，芒果苷5%，提取得率约11%。

以上工艺制备所得的山药提取物、知母提取物、乌梅提取物按照2:2:1混合均匀，制得山药乌梅知母提取物混合粉，人体推荐剂量2g/人/d，折算到山药提取物为0.8g/人/d、知母提取物为0.8g/人/d、乌梅提取物为0.4g/人/d。

1.2实验动物SPF级昆明种小鼠，体重25～35g，SPF级健康离乳SD大鼠，体重180～220g，雌雄各半。

2 试验方法

2.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用SPF级健康离乳SD大鼠20只，雌雄各半。急性经口毒性剂量为20.0g/kg.bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

2.2 细菌回复突变试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法，证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。

2.3 哺乳动物红细胞微核试验：选用SPF级昆明种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。受试样品最高剂量设10.0g/kg.bw，中、低剂量设5.0g/kg.bw、2.5g/kg.bw，同时设溶剂对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数

200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为15μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

2.5 90天经口毒性试验：选用体重80±5g SPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各半，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的100、200、300倍即3.33g/kg.bw、6.67g/kg.bw、10.00g/kg.bw给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

2.6 致畸试验：对受孕SD大鼠于受孕第6天-第15天每天灌胃分别给予3.33g/kg.bw、6.67g/kg.bw、10.00g/kg.bw剂量的山药乌梅知母提取物混合粉，阳性对照组给予0.28g/kg.bw的阿司匹林，于孕第20天处死孕鼠，解剖观察孕鼠胚胎毒性指标及胎鼠生长发育指标。

3 结果

3.1 大鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠山药乌梅知母提取物混合粉急性经口毒性试验LD50＞20.0g/kg.bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。结果见表1。

表1 急性毒性试验结果

3.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

3.3  90天经口毒性试验：以3.33g/kg.bw、6.67g/kg.bw、10.00g/kg.bw剂量的山药乌梅知母提取物混合粉经灌胃给予大鼠，连续90天。各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）；各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化；各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平等血生化指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

3.4 致畸试验：见表1，阳性对照组孕鼠活胎数显著低于阴性对照组（P<0.05），死胎及吸收胎的发生率显著高于阴性对照组（P<0.05）；各剂量组孕鼠着床数、活胎数、死胎及吸收胎发生率与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。

表1 山药乌梅知母提取物混合粉对孕鼠胚胎毒性指标的影响（x±s）

阳性对照组实验末期体重、总增重及子宫连胎重均显著低于阴性对照组（P<0.05），胎鼠体重、体长显著减少（P<0.05），前囟宽、头骨、胸骨、肋骨、四肢骨、脊骨、骨盆骨发育不全的异常率显著高于阴性对照组（P<0.05）；阳性对照组部分胎鼠出现明显的外观、内脏、骨骼畸形。各剂量组孕鼠体重、增重、子宫连胎重、胎鼠体重、体长、胎鼠外观、骨骼及内脏发育情况与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。

4结论根据GB 15193.1-2014 食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序，本研究针对山药乌梅知母提取物混合粉长期食用安全性进行了研究，采用限量法，在本试验条件下山药乌梅知母提取物混合粉雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；山药乌梅知母提取物混合粉以3.33g/kg.bw、6.67g/kg.bw、10.00g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。山药乌梅知母提取物混合粉以3.33g/kg.bw、6.67g/kg.bw、10.00g/kg.bw的剂量进行致畸试验，结果山药乌梅知母提取物混合粉对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性，为山药乌梅知母提取物混合粉应用于保健食品提供了安全性依据。

参考文献

[1]赵利新．山药的药理作用及食用价值研究进展[J].食品安全导刊，2020，1：90．

[2]江苏新医学院．中药大辞典（第2版）［M］．上海：上海科学技术出版社,1986．464.

[3]倪梁红，秦民坚．知母资源化学及药理研究进展[J].中国野生植物资源，2005，24(4)：16-20．