人工牛黄中胆酸原料的质量控制

人工牛黄中胆酸原料的质量控制

龙四清，宋卫星

（湖南迪博制药有限公司，湖南，长沙，410331）

【摘要】目的：研究人工牛黄中胆酸原料的质量控制，以判定胆酸的质量及掺伪判定，以确保胆酸的质量。方法：采用HPLC-ELSD法测定胆酸中游离胆酸的含量；采用ACCHROM Xaqua C18色谱柱（250mm*4.6mm，5um），使用以乙腈为流动相A，以0.2%三氟乙酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；用蒸发光散射检测器检测。结果：回归方程为y=11.503+1.3828x，R2=0.9999。结论：所建立的检测方法灵敏、准确，与中国药典紫外分光光度法检测结果比较，可用于对胆酸的起始物料胆源的质量掺伪问题进行判定。

关键词：胆酸；质量控制

人工牛黄具有清热解毒、化痰定惊，用于小儿急惊风、咽喉肿痛、口舌生疮等，作为中药原料药，广泛应用于几百种药物制剂处方中，作为天然牛黄的代用品，有效缓解了天然牛黄的稀缺所引起的困难，解决了牛黄的价格昂贵带来的药品可及性的问题。其中胆酸作为人工牛黄的其中的主要成份起关键作用。

胆酸虽然由于生产工艺简单，起始原料来源复杂，导致产品的质量参次不齐，严重影响人工牛黄的质量。按照中国药典的标准规定，胆酸应当由牛、羊胆汁或胆膏经提取、加工制成。但在使用使用过程中，发现部分厂家的胆酸使用鸡胆来进行生产的问题，因鸡胆做成的胆酸价格便宜，个别厂家为降低生产成本，使用了鸡胆来源的胆酸，造成了恶性竟争，且对人工牛黄的质量控制造成不好的影响，已影响人工牛黄生产企业的正常竟争。中国药典中的胆酸质量标准中规定了的含量测定方法，主要是用紫外分光光度法，但测量的是总胆酸的含量，通过分析，胆酸原料中胆酸大多以游离胆酸的形式存在，但也有部分结合胆酸的形式存在，主要的结合胆酸形式为牛磺胆酸、甘氨胆酸等其他胆汁酸类，但结合胆酸的含量

不是很高，经文献资料及使用纯牛胆按生产工艺制成的胆酸进行实验，确定了胆酸中游离胆酸用二种方法引起的含量差应在5%-10%之间。我公司通过用一种HPLC-ELSD法，测量胆酸含量，同时也能同时测定去氧胆酸、鹅去氧胆酸等其他胆酸类成分的方法，与中国药典2020年版一部规定的方法测得的结果比较，可有效控制胆酸的质量,识别胆酸可能存在的胆源掺伪情况,为提高胆酸的内控质量标准及加强质量验收提供参考和依据。

1 仪器与试剂

1.1仪器

LC2030 液相色谱仪（岛津公司）

HN1006超声波清洗器（广州华南超声仪器公司）

MS205DU电子天平（梅特勒-托利多）

PLSW-DI-20自动纯水机

C 18色谱柱（ACCHROM Xaqua）

1.2试药：

胆酸对照品（10078-201415中国食品药品检定研究院），乙腈（色谱纯 SIGMA），水（自制超纯水），三氟乙酸（20220206 天津富宇精细化工）

2方法与结果：

2.1 检验方法1：HPLC-ELSD法

2.1.1溶液的制备

2.1.1.1对照品溶液的制备

取胆酸对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇制成每1ml含胆酸0.5mg的溶液，即得。

2.1.1.2供试品溶液的制备

取本品约25mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50ml,称重，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2色谱条件与系统适应性：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（ACCHROM Xaqua，柱长为25cm，柱内径为4.6mm，粒径为5µm）；以乙腈为流动相A，以0.2%三氟乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按胆酸峰计算应不低于8000。

时间（分钟）    流动相 A（%）      流动相 B（%）

0～30          25→52             75→48

30～45           52                 48

胆酸对照品溶液对照图，见图1。

                          A

图1  胆酸对照品溶液色谱图（注： A，胆酸）

2.1.3方法学考察：

2.1.3.1线性关系考察：

精密称取胆酸对照品溶液，分别进样量3，5，10µl，测定胆酸峰面积。以胆酸对照品的进样量质量对数为横坐标，以胆酸色谱峰面积对数为纵坐标，用外标对数方程分别计算含量回归方程，回归方程为y=11.503+1.3828x，R2=0.9999，胆酸对照品进样质量在1.487µg→4.957µg范围内呈良好的线性关系。

2.1.3.2精密度试验：

取供试液品溶液连续进样6次，进样量5µl，测定胆酸峰面积，胆酸峰面积对数的RSD为1.1%。

2.1.3.3稳定性

取新鲜制备的供试品溶液，分别间隔0、4、8、12、24小时，精密进样5µl，测定峰面积，得平均峰面积对数为12.757，RSD=0.87%。结果表明在24小时内供试品溶液基本稳定。

2.1.3.4重复性

取同一批号的供试品溶液平行进样6次，进样5µl测定胆酸峰面积，计算含量的RSD为0.78%。

2.1.3.5回收率

取已知含量的供试品，按上法制成供试品溶液，在50%、100% 2个水平进行加样回收试验，每个水平重复3次，并计算平均值，如下表1所示，胆酸的平均加样回收率为99.%，RSD=1.35%。

表1：胆酸加样回收率

取样量 样品含量    加入量 测得量 回收率 平均回收率   RSD

（mg）   (mg)       (mg)   (mg)     (%)      （%）     （%）

25.10    20.38     10.01   30.20   98.1       99.3      1.35

25.02    20.32     10.05   30.35   99.8

24.83    20.16     10.11   30.30   100.3

24.93    20.24     18.01   37.96   98.4

24.78    20.12     19.21   39.68   101.8

25.24    20.49     19.32   39.69   99.4

2.2 检验方法2：

紫外分光光度法（见中国药典2020年版一部P5人工牛黄附胆酸含量测定方法）

2.3样品测量

取不同厂家，不同动物胆汁来源的胆酸，分别按二种检测方法进行实验，检测胆酸含量，结果见下表：

   表2： 不同厂家不同不同胆汁来源的胆酸含量检测结果

生产厂家    来源       HPLC法 药典法（UV法）

A          牛胆        81.2%     90.3%

B          牛胆        84.5%     91.7%

C          牛胆        77.7%     86.3%

    D          鸡胆        68.6%     87.2%

D          鸡胆        76.9%     93.1%

F          鸡胆        74.5%     91.2%

3.结论：

在此次样品检测中，使用药典法测出来都是总胆酸的含量，都大于药典标准（80.0%），使用牛胆生产的胆酸中游离胆酸含量，与药典法检测结果比较，二种方法的检测误差都在7%-10%之间；而采用鸡胆生产的胆酸，当其不是太纯时，使用液相色谱法测得的游离胆酸含量，与药典法测得的含量之间会差异得大（大于15%），通过建立以上游离胆酸的高效液相色谱法检测方法，测得的几个批次不同动物胆汁来源的胆酸含量，可以对判定他们是否是来源于鸡胆生产的胆酸，对控制胆酸的来源及合规性都有很好的作用。

通过此方法，可真实反映胆酸的质量，对保证人工牛黄的质量控制及人工牛黄的疗效、安全性有一定促进作用。

【参考文献】

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