熊去氧胆酸胶囊的微生物限度检查方法学验证

熊去氧胆酸胶囊的微生物限度检查方法学验证

李国琼1符兴远2

1 海南省药品查验中心 海南海口 570216

2 海南赛立克药业有限公司 海南海口571126

摘要 目的：建立熊去氧胆酸胶囊的微生物限度检测方法。方法：按照《中国药典》2020版通则1105、1106，采用平皿计数法,分组分别使用5种实验菌验证。试验组取供试液加菌液注入培养基中培养。菌液组分别取各实验菌液注入培养基中培养。阴性对照组取稀释剂注入培养基中培养。供试品对照组取供试液注入培养基中培养。通过3次独立的平行试验,分别计算各试验菌每次试验的回收率并对控制菌的检查法进行适用性试验,确定适宜的微生物限度检查方法。结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率在0.5～2之间，大肠埃希菌(控制菌检查)适用性试验满足要求。结论：该方法适用性试验表明所建立方法准确性、有效性及重现性较好,可用于熊去氧胆酸胶囊的微生物限度计数和控制菌检测。

关键词：微生物限度；熊去氧胆酸胶囊；适用性试验；平皿法

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0引言

微生物限度检查法系指检查非无菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数、霉菌数和酵母菌总数、控制菌检查[1]。熊去氧胆酸胶囊原研来自德国Dr Falk，临床上主要用于治疗胆囊胆固醇结石、胆汁淤积性肝病等疾病, 在体内溶解胆固醇结石的效果较好，且副作用相对较少，属于主流的利胆药。主要成分为熊去氧胆酸。该成分为内源性物质,体内处置过程复杂 [2]

现根据中国药典（2020年版）要求，对非无菌制剂及其原料、辅料进行微生物限度检查,同时进行方法学验证。为确保检验方法的准确性和可靠性,对该品种的微生物限度检查进行了计数方法的验证及控制菌检查方法的验证。

1实验部分

1.1仪器

SW-CJ-2FD-II洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；YXQ-LB-50SII高压蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器厂)；ACS-1电子天平(中山市恒新电子有限公司)；SHH-400L生化培养箱(重庆康城永生试验设备有限公司)；BCD-166WM冰箱(美的)

1.2药品

熊去氧胆酸胶囊(批号：20230601、20230602、20230603，海南赛立克药业有限公司)。

1.3试验菌种

金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、铜绿假单胞菌［CMCC(B) 10 104］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］。购于中国食品药品检定研究院，

传代为第2代，工作用菌为第3代。注：下列正文中菌种名称采用菌种编号代替。

1.4培养基与试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、麦康凯液体培养基(MCB)、麦康凯琼脂培养基(MCA)、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(SCP)以上干粉培养基均购于广东环凯微生物科技有限公司；下列正文中培养基名称采用培养基通用缩写代替。

1.5 菌液、培养基、溶液制备

将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和大肠埃希菌制备参照《中国药典》2020 版通则1105、1106“菌种及菌液制备”进行新鲜浓菌液的制备。将浓菌液逐步进行稀释，使其最后的菌液计数结果不大于100cfu/mL，菌液在2～8℃保存，在24h内有效。

培养基的制备参照说明书进行配制与灭菌，按照《中国药典》2020版通则1105项下“表1 试验菌液的制备和使用”中的“计数培养基适用性检查”规定，接种不大于100cfu的菌液至TSB或TSA平板或SDA 平板中；用相应的对照培养基替代被检培养基进行同法操作。将所有培养物在表1规定条件下培养，每天计数，计数结束后把被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.5～2.0范围内，表示结果满足要求，该培养基可在进行后续试验中使用。

1.6 供试液的制备

称取本品10g，加入pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使供试品分散均匀，作为1：10的供试液，待用。

2结果与讨论

2.1微生物限度计数方法适用性试验

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2.1.1试验样品溶液的制备

(1)试验组：取5支无菌试管，分别加入A供试液9.9mL，再分别加入表1中菌液0.1mL(含菌量为500～1000cfu)，混匀待用

(每1mL供试液中含不大于100cfu菌量)。

(2)菌液对照组：取5支无菌试管，分别加入SCP 9.9mL，再分别加入表1中菌液0.1mL(含菌量为500～1000cfu)，混匀

待用(每1mL缓冲液中含不大于100cfu菌量)。

(3)供试品对照组：取1支无菌试管，加入A供试液9.9mL和0.1mLSCP，混匀待用。

(4)阴性对照

组：取SCP  1mL采用平皿法，同试验组操作。

微生物限度检查回收率的计算公式：

试验组回收率=

2.1.2检测

操作步骤：分别取上述溶液各1mL注入平皿中，倾注15～20ml TSA和SDA，每种菌平行制备两个平皿，倒置在培养箱

中培养。混匀，凝固后倒置在培养箱中培养。

2.1.3培养计数

培养基和培养条件

①TSA培养时间：CMCC(B)26003、CMCC(B)10104、CMCC(B)63501菌株在30～35 ℃培养时间不超过3d，CMCC(F)98001、CMCC(F)98003菌株在30～35℃培养时间不超过5d。

②SDA培养时间：CMCC(F)98001、CMCC(F)98003菌株在20～25℃培养时间不超过5d。

2.1.4判断标准

结果判断方法适用性试验中，若采用平皿法方法适用性试验各试验菌回收率应在0.5~2范围内，若各试验菌的回收率均符合规定照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

2.1.5 试验结果

试验结果表明采用平皿法方法适用性试验各试验菌回收率均在0.5~2范围内，各试验菌的回收率均符合规定。实验结果如表1、表2所示。

表1 需氧菌总数

图1 需氧菌总数回收率分布图

表 2 霉菌及酵母菌总数

图 2 霉菌及酵母菌总数回收率分布图

表3 大肠埃希菌控制菌检查结果

2.2控制菌检查方法的适用性试验

2.2.1 大肠埃希菌控制菌检查：

检验方法：依据《中国药典》2020年版四部通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法。

试验组：取1：10供试液10ml直接接种置100ml无菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，加入1ml浓度不大于100cfu的大肠埃希菌菌液，混匀，置30～35℃培养18～24h；取1ml胰酪大豆胨液体培养物接种至100ml无菌麦康凯液体培养基中，置42～44℃培养不超过48h；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置30～35℃培养18～24h。

阳性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，直接接种置100ml无菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，加入1ml浓度不大于100cfu的大肠埃希菌菌液，同试验组操作及培养。

供试品对照组：取1：10供试液10ml直接接种置100ml无菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，不加菌液同试验组操作及培养。

阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，直接接种置100ml无菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，不加菌液同试验组操作及培养。

2.2.2 结果要求

试验组、阳性对照应检出大肠埃希菌，供试品组、阴性对照组不得检出大肠埃希菌。实验结果如表2所示。若供试品在麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的坚定试验，确认是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。

2.2.3 试验结果

供试品在麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，供试品未检出大肠埃希菌，见表3。

2.3讨论

由于未经方法学验证的微生物限度检查,将影响微生物限度检查结果的准确性,容易造成假阴性或给出错误的合格结论,对患者安全用药埋下隐患。按照中国药典2020年版微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查，解决了药物抑菌成分的存在对微生物限度检查产生的干扰,能够真实、客观地反映药物的染菌情况,使检查结果科学、准确、可信。在处方、生产工艺及检测环境不变的情况下,可按上述验证后的方法进行微生物限度检查。

通过以上微生物限度检查方法适用性试验可知：建立的熊去氧胆酸胶囊微生物限度检查的方法: 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率在0.5～2之间，故本品无抑菌作用，控制菌检查阳性菌生长良好,说明本品对大肠埃希菌没有抑菌作用。阴性菌均未检出，表明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。

综上所述所建立方法准确性、有效性及重现性较好,可用于熊去氧胆酸胶囊的微生物限度计数和控制菌检测。

2 参考文献

  [1]中国药典委员会.中华人民共和国药典(2020 年版四部)[M].北京：中国医药科技出版社，2020.

[2].国家药品监督管理局.熊去氧胆酸胶囊说明书.2015.

[3].《药品生产质量管理规范》（2010版）及其附录.

作者简介：李国琼（1970-），女，本科，高级工程师，从事药品检查、监督管理工作

基金项目:本文系2021年海南省自然科学基金面上项目“水分活度在非无菌药品微生物控制中的应用”（项目编号：821MS0817)的部分研究成果。