七氟烷对小鼠肾缺血再灌注模型下肾小管氧化应激损伤的干预作用及机制研究

七氟烷对小鼠肾缺血再灌注模型下肾小管氧化应激损伤的干预作用及机制研究

孙越祥1 李春阳1 吴佳豪1 曹煜1 隋宏书2*

1. 山东第一医科大学临床与基础医学院  山东  济南 250000 
2. 山东第一医科大学临床与基础医学院组织学与胚胎学系  山东  济南250000

[摘要]：目的：探索七氟烷对小鼠肾缺血再灌注氧化应激损伤的干预作用及机制。方法：36只C57小鼠随机分为假手术，手术和干预组。实验前分笼同条件饲养两周。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠。麻醉干预组术前吸入七氟烷，余组夹闭双侧肾蒂，45分钟恢复灌流建立模型。实验结束进行肾脏病理学分析，评价肾小管坏死指标并检测氧化应激指标。综合数据计算分析，探讨七氟烷对小鼠肾缺血再灌注氧化应激的保护作用。结果：七氟烷组相比于对照组肾脏损伤程度低，肾小管损伤轻，血清尿素氮肌酐含量降低。结论：七氟烷对小鼠肾缺血再灌注氧化应激具有一定的保护功能。

关键词：缺血再灌注损伤；肾脏；七氟烷

中图分类号： Q813.7            文献标识码：A

第一作者：孙越祥，2021级麻醉学本科在读本科生

*通讯作者：隋宏书，山东第一医科大学临床与基础医学院组织学与胚胎学系，Tel：18668956682，Email：hongshusui@163.com

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.S202310439086）

1. 前言

肾缺血再灌注（RIRI）损伤是由肾脏灌注不足所致，伴随系列细胞事件导致组织损伤，常见休克或肾移植等临床治疗过程，是导致急性肾损伤（AKI）的重要原因之一，在肾移植手术、休克等过程中不可避免。目前仍旧以传统保守治疗作为关键疗法，且发病机制有待深究。七氟烷（Sevoflurane）可下调IL-6及TNF-α的水平促进细胞修复，且预见性保护损伤组织，其机制可能与七氟烷抑制炎症介质释放相关[1]。故本项目以七氟烷为切入点研究其干预机制，为临床诊治肾缺血再灌注损伤提供新的思路。

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

36只起始状态相近的C57雄性小鼠（7周龄，20±5g）（济南朋悦实验动物繁育有限公司）

2.1.2主要试剂

吸入用七氟烷购自鲁南制药集团山东新时代药业有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒均购自南京建成生物研究所。

2.2实验方法

2.2.1分组及模型建立

小鼠随机分为A假手术，B手术和C干预组。实验前所有小鼠分笼同条件饲养两周。C组术前吸入七氟烷。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，A组不夹闭左右肾蒂，分笼饲养；BC组夹闭，45分钟恢复灌流建立模型。

2.2.2标本采集

术后3、6、12、24h每组心脏取血2mL，取左肾HE染色；取右肾用于氧化应激水平测定，Wb法蛋白检测等。

2.2.3肾组织病理检测

光镜观察标本，对比肾小管形态学变化。根据Jab lonski等制定的坏死程度进行评价。

2.2.4TUNEL技术检测各组肾小管细胞凋亡指数

根据说明书的方法，以胞核染成棕黄色者为阳性，选定区域计算上皮细胞及肾小管凋亡率。

2.2.5检测各组肾组织氧化应激水平及功能水平[2]

组织匀浆并离心（3000r/min，10min)，收集上清液测SOD活性及MDA水平。操作按说明书步骤进行。用生化分析仪测定血清肌酐（Cr）。

2.2.6免疫印迹法检测IL-6与TNF-α因子水平

组织匀浆提取蛋白，BCA法测定细胞因子浓度。采用Wb法检测，用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

2.3统计学分析

实验重复三次以上，SPSS17.0软件分析。三组间采用单因素方差分析。两组间采用独立样本t检验。p<0.05有统计学意义。

3.结果

3.1肾脏病理学变化

光镜下可见三组小鼠左肾组织HE染色切片（如图1所示）。假手术组（A组）无明显改变。模型组（B组）可见炎细胞浸润，上皮细胞坏死脱落，发生缺血再灌注损伤。七氟烷组（C组）炎细胞浸润减少，肾小管损伤程度减轻，肾小管上皮细胞部分存活。

图1.小鼠肾脏组织病理学变化（HE染色，A.对照组；B.模型组；C.七氟烷干预组）

3.2血肌酐水平检测

图2.各组小鼠血肌酐水平的检测

三组小鼠的血生化血清肌酐（Cr）检测对比如图2所示。模型组和假手术组相比差异显著，表明已引发损伤。七氟烷与假手术组比明显降低，说明七氟烷有明确的干预和保护。

3.3肾组织氧化应激水平检测

图3.各组小鼠肾组织氧化应激水平的检测

三组肾组织的SOD与MDA数据对比如图3所示。与假手术组相比，模型组SOD水平降低而MDA水平升高。相比模型组，七氟烷组SOD水平升高而MDA水平下降，说明七氟烷对肾缺血再灌注损伤具有积极保护效果。

4. 讨论

本试验研究从调控氧化应激的角度出发探讨七氟烷对肾小管的保护。通过夹闭双肾蒂45分钟恢复灌流成功建立小鼠肾缺血再灌注模型。与模型组相比，七氟烷组得到保护，提示七氟烷对减轻肾缺血再灌注损伤有积极作用。证明七氟烷对小鼠肾缺血再灌注损伤

确有预见性保护。

陈光磊等[3]建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型；余晓东等[4]也成功建立模型，并认为该模型提供强而有力。研究表明，RIRI造成的肾小管功能受损确与ROS的过度表达有关[5,6]。蒋鹏等[8]的研究发现及时使用抗氧化药物清除氧自由基可有效抑制肾脏损伤加剧，说明氧自由基在RIRI引导下严重破坏肾小管等肾脏组织。大量研究表明[5-7]，RIRI患者血项检测和RIRI小鼠模型血项检测中，氧化产物如MDA明显升高，而抗氧化酶如CAT、SOD、GSH-Px等显著降低。且患病时间越长，这种趋势越明显。

近年体外实验中，七氟烷表现出降低炎症反应和无抗炎抗氧化两种互斥的作用。而大部分体内实验提示七氟烷对各种动物模型均有抗炎作用，并认为与凋亡相关基因调节相关。以上研究均表明七氟烷有调控氧化应激，减少炎性细胞因子对细胞组织损伤的药理效果，与本实验相符。

本实验亦存在不足，对于七氟烷发挥作用的具体分子机制未进一步探索，后续将进一步探究七氟烷在肾缺血再灌注损伤保护中调控细胞抗氧化应激的原理。

参考文献

[1]于洋，马骏．七氟烷预处理与后处理对大鼠离体心脏再灌注 心律失常的影响［J］．中国医药，2017，12( 1) : 14-18

[2]王可娜,张娇,徐家云.西地那非对肾缺血再灌注损伤大鼠氧化应激及肾小管细胞凋亡的影响[J].长春中医药大学学报,2022,38(11):1217-1221.

[3]陈光磊,王汉民,刘广厚,等．大鼠急性肾脏缺血再灌注后处理动物模型的建立[J]．第四军医大学学报, 2007, 28(9):812-814．

[4]余晓东,廖波,邓显忠,等.一种新型实用的大鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立[J].重庆医学,2011,40(13):1283-1284+1353-1354.

[5]任冰霜,雷艳,黄梁浒.肾脏缺血再灌注损伤的分子机制[J].实用医学杂志, 2016, 32 (10): 1710 -1712.

[6]蒋鹏,尤剑鹏,高宏君.肾脏缺血-再灌注损伤防治的研究进展[J].器官移植,2016,7(01):78-81.

[7]陈建,吴卫真,余毅等.黄芪对肾缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华泌尿外科杂志, 2000 (04):18-19.基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.S202310439086）