槲皮素对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制研究

槲皮素对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制研究

王泓恺1# 赵潇涵1#荆钰含1 张怡淼1 隋宏书2*

1. 山东第一医科大学临床与基础医学院  山东 济南 250000
2. 山东第一医科大学组织学与胚胎学系   山东  济南  250000

【摘要】 目的 研究槲皮素对小鼠酒精性肝损伤的干预保护作用及机制研究。方法适应性饲养雄性KM小鼠一周后，根据体重将其随机分成三组：对照组（A组）、模型组（酒精肝）（B组）、槲皮素组（C组），每组20只，C组预防性灌胃给予槲皮素100mg/(kg·bw·d)，A组和B组给予等量生理盐水，持续两周，最后一次灌胃禁食8h后进行酒精造模，A组灌胃生理盐水，B组和C组灌胃50％的乙醇溶液（4. 8 g / kg）12h后处死3组小鼠，眼球采血并检测ALT、AST水平，计算肝脏指数，HE染色法观察小鼠肝脏变化，进行数据统计与分析。结果槲皮素能降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT和AST水平，与酒精组相比，槲皮素预处理能降低肝脏指数，肝组织病理结果显示槲皮素能改善酒精性肝损伤。结论槲皮素对酒精性肝损伤有预防性的保护作用。

关键词：酒精肝，槲皮素，小鼠

中图分类号: Q813.7            文献标识码：A

第一作者：王泓恺，2021级临床医学本科专业在读本科生

共同第一作者：赵潇涵，2021级临床医学本科专业在读本科生

*通讯作者: 隋宏书，Tel：18668956682，E-mail:hongshusui@163.com

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2023104391043）

1. 前言

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是指长期大量饮酒所造成的一系列肝脏疾病，早期可从酒精性脂肪肝发展为酒精性脂肪肝炎，晚期最后演变为难以治愈的肝硬化甚至肝细胞癌[1-2]，因此在发病早期进行干预意义重大。槲皮素是自然界分布最广的天然黄酮之一，含大量酚羟基，有较强的清除活性氧自由基能力，能在一定程度上对抗氧化应激所致细胞损伤[3]，而且槲皮素可以抑制TNF-α基因和(IL)-6的基因表达，减轻炎症[4]，有研究表明，槲皮素可以抑制GRP78，从而缓解内质网应激来预防细胞死亡[5]。本文将外探讨槲皮素对酒精性肝损伤小鼠的防护效应及作用机制，以期为酒精性肝损伤的临床治疗提供思路。

2. 材料与方法

2.1 实验动物

购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，（15±2）g SPF 级昆明系（KM）雄性小鼠。

2.2 造模与分组

适应性饲养雄性KM小鼠一周后，根据体重将其随机分成三组：对照组（A组）、模型组（酒精肝）（B组）、槲皮素组（C组），每组20只，C组预防性灌胃给予槲皮素100mg/(kg·bw·d)，A组和B组给予等量生理盐水，持续两周，最后一次灌胃禁食8h后进行酒精造模，A组灌胃生理盐水，B组和C组灌胃50％的乙醇溶液(4. 8 g / kg），建立起急性酒精性肝损伤模型。

2.2.1 观察指标及方法

酒精灌胃12h后，处死3组小鼠，眼球取血，解剖后取小鼠肝脏，将其HE染色制成切片观察。计算小鼠肝脏指数，测量小鼠血清中ALT、AST指数。

2.2.2 HE染色法观察肝脏形态

取出三组小鼠肝脏，将其用多聚甲醛浸泡，经修剪、酒精脱水、苯溶液浸泡、石蜡包埋，再经切片、展片、烤片、脱蜡、至水、染色得到小鼠肝脏HE染色的病理组织切片，将各组切片在光镜下观察肝脏的组织形态变化和细胞状态。

2.2.3肝脏指数计算

根据记录的小鼠体质量和肝脏湿重，根据公式计算出肝脏指数进行对比，公式为：肝脏指数=肝脏湿重/小鼠体质量*100%

2.2.4 血清肝功能生化指标检测

将小鼠处死后，眼球采血，冰冻得到的血清，实验时将样品从-80°C冰箱中取出后融化，将各组血清样品放入全自动生化分析仪，检测血清中 ALT、AST水平。

2.3 统计学方法

采用SPSS27.0 软件分析对实验数据进行处理，作图软件则选用 GraphPadPrism 10.0;计量资料采用(mean±SD)表示。3 组的多样本间的数据比较采用单因素方差分析，多重比较使用 LSD方法。如果数据不符合单因素方差分析的条件，则采用秩和检验。P<0.05为差异则有统计学意义。

3.结果

3.1 小鼠肝组织病理变化

图1. 各组小鼠肝组织病理变化（H&E染色，A.对照组；B.模型组；C.槲皮素组）

图1所示，对照组小鼠肝细胞排列规律，组织结构正常清晰，无变性坏死。模型组细胞大小不一，排列不紧凑，数量减少，肝细胞中间出现的空白部分为脂肪组织。槲皮素组肝组织病变减轻，肝细胞轻度脂肪变性，排列较酒精肝模型组更整齐紧密，也更有规律。故与对照组比，酒精肝模型组肝组织损伤严重，槲皮素干预组肝病理表型减轻。

3.2 小鼠肝脏指数的测定

图2. 各组小鼠肝脏指数的测定

图2所示，相比于模型组，对照组和槲皮素组肝脏指数显著降低，槲皮素组与对照组差异不显著。故与酒精组相比，槲皮素预处理能降低肝脏指数。

3.3 小鼠肝组织ALT和AST活力的检测

图3. 各组小鼠肝组织ALT和AST水平的检测

图3所示，与对照组相比，模型组与槲皮素组ALT、AST水平显著升高，表明酒精产生了肝脏组织损伤。但槲皮素组与模型组相比，槲皮素组ALT、AST水平明显降低，表明槲皮素能降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT和AST水平。

4.讨论

一次性摄入大量酒精是导致急性肝损伤的重要因素，本次实验在酒精灌胃之前，对动物喂养14天的槲皮素进行预保护，第15天灌入50%乙醇溶液，检测生理指标，观察槲皮素对酒精性肝损伤的保护作用，符合临床实际情形。模型组中模型组小鼠血清中ALT和AST水平显著升高，肝细胞大小不一，肿胀坏死，说明小鼠造模成功。槲皮素组肝脏组织细胞得到改善，损伤较少，血清中AST、ALT浓度较低，提示槲皮素对小鼠急性酒精性肝损伤有保护作用。已查阅的文献报道中也已有多项研究选择不同的药物治疗酒精性肝损伤，如睡莲酚[6]、败酱草[7]、玉米肽[8]。上述文献中，对于酒精性肝损伤治疗的判断是肝脏的病理学改变，血清的AST、ALT指数测量等，与本文使用实验验证方法相同，故我们可以通过此项目对酒精性肝损伤治疗与防护探索新的方案。但是由于酒精性肝损伤内在机制复杂，本实验应该进一步进行槲皮素治疗酒精性肝损伤的分子机制研究，针对某一通路进行研究对比，为疾病的治疗提供新的方向。本课题组将继续深入研究槲皮素的作用机制，为临床精确精准用药提供参考。

参考文献[ ]基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2023104391043）

[1][ ]Seitz HK, Bataller R, Cortez-Pinto H, et al. Alcoholic liver disease [J].Nat Rev Dis Primers. 2018; 4(1):1-22

[2]Asrani SK, Devarbhavi H, Eaton J, et al. Burden of liver diseases in the world [J]. J Hepatol. 2019;70(1):151-171.

[3]Nathiya, S., Durga, M., & Devasena, T. Quercetin, encapsulated quercetin and its application—A review. Analgesia,2014, 10(11).

[4]陶真茂,杨振,郭春峰,等.槲皮素通过抑制TLR4/NLRP3信号通路挽救缺血再灌注诱发的大鼠心肌细胞凋亡的研究[J].解剖学研究,2023,45(04):307-313+321.

[5]Eisvand F, Tajbakhsh A, Seidel V,et al. Quercetin and its role in modulating endoplasmic reticulum stress: A review. Phytother Res. 2022;36(1):73-84.

[6]郭子雨,赵军,姚雨含,等.睡莲酚对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].药学研究,2023,42(09):668-672.

[7]王如萍,刘梦姣,田梦新,等.败酱草对小鼠急性酒精性肝损伤作用的研究[J].中医临床研究,2023,15(20):137-142.

[8]黄子涵,毛新亮,余宗盛,等.玉米肽保护急性酒精性肝损伤的作用研究[J/OL].今日药学:1-10[2023-10-13].