锌指蛋白A20在细菌感染中发挥的作用

锌指蛋白A20在细菌感染中发挥的作用

刘松    李聪（通讯作者）

 重庆市黔江中心医院    409000

摘要:目的探究细菌感染机体后血清锌指蛋白A20的表达效果，探讨A20在细菌复制中所发挥的作用机制。方法：选取我院248例血培养瓶细菌检测阳性的病例血清样本作为研究对象，选取80例健康体检样本作为阴性对照组，采用ELISA方法检测所有样本血清锌指蛋白A20浓度。结果：（a）细菌感染组血清锌指蛋白A20水平显著高于阴性对照组血清锌指蛋白A20水平（P<0.01）；（b）革兰阴性菌感染组、革兰阳性菌感染组血清锌指蛋白A20明显高于阴性对照组（P<0.01）；（c）大肠埃希菌感染组与阴性对照组间血清锌指蛋白A20差异具有统计学意义（P<0.01）；（d）金黄色葡萄球菌感染组、凝固酶阴性葡萄球菌感染组与阴性对照组间血清锌指蛋白A20差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：细菌感染时血清锌指蛋白A20表达上调，在细菌感染和复制中发挥重要作用。

关键词：锌指蛋白A20；细菌感染；NF-κB；炎症反应

The role of zinc finger protein A20 in bacterial infection

Liu Song and Li Cong (corresponding author) , Qianjiang Central Hospital, Chongqing409000

Abstract:Objective To investigate the expression of serum zinc finger protein A20 after bacterial infection and to explore the mechanism of A20 in bacterial replication.Methods The serum samples of 248 blood culture bottles in our hospital were selected as the research objects, and 80 healthy samples were selected as negative control group. The serum zinc finger protein A20 concentration was detected by ELISA method.Results(I) the level of serum zinc finger protein A20 in serum of bacterial infection group was significantly higher than that of serum zinc finger protein A20 (P<0.01) in negative control group (P<0.01); (II) the serum zinc finger protein A20 of gram negative bacteria infection group and gram positive bacterial infection group was significantly higher than that of negative control group (P<0.01); (III) Escherichia coli infection group and negative control group (III) The difference of serum zinc finger protein A20 between groups was statistically significant (P<0.01); (IIII) the difference of serum zinc finger protein A20 between the Staphylococcus aureus infection group, the coagulase negative staphylococcal infection group and the negative control group was statistically significant (P<0.01).Conclusionthe expression of serum zinc finger protein A20 is upregulated in bacterial infection and plays an important role in bacterial infection and replication.

Keywords: zinc finger protein A20, bacterial infection, nuclear factor-kappa B, inflammatory response

锌指蛋白A20，分布于体内多种细胞内90kDa大小的炎症调节蛋白，在炎性反应过程中内源性表达。作为负向调控因子，在发挥调控功能时主要利用泛素化和去泛素化双重酶作用介导转导信号通路，抑制炎症因子的表达，从而参与机体内多种途径介导的炎症反应过程。近年来，A20的一些新功能备受关注，在自噬、焦亡和程序性坏死等免疫防御机制中起到重要作用，Shi CS[1]利用IL-γ或IL-1处理巨噬细胞，引发了K63位泛素化修饰的Beclin-1和自噬体的形成，而去泛素化酶A20能降低Beclin-1 K63位泛素化修饰的程度进而限制自噬在TOLL样受体（TLRs）信号的响应。Li等[2]利用腺病毒介导A20基因在巨噬细胞中过表达，发现A20可通过抑制NF-κB途径从而抑制NLRP3炎症体的激活，大鼠狼疮性肾炎得到明显的减轻。金黄色葡萄球菌诱导的血流感染中NLRP3炎性小体含量明显升高[3]。Lamkanfi[4]在nature上发表的一个课题发现A20缺失的巨噬细胞在脂多糖的刺激下，可以显著提高NLRP3介导的caspase-1激活，从而引起IL-1β的释放和发生细胞焦亡。因此，说明A20具有调控NLRP3炎性小体的功能。Gurung P[5]和Onizawa M[6]发现A20缺失的T细胞和成纤维细胞容易引起RIPK3介导的程序性细胞坏死。生理状态下的RIPK3 的K5 位为泛素化修饰。并且K5 位泛素化修饰RIPK3是程序性坏死最重要的复合体RIPK1-RIPK3 复合体形成的关键位点，而A20可以通过抑制程序性坏死的关键分子RIPK3 的泛素化，保护细胞不发生程序性坏死。

此次试验的前期研究发现，化脓性链球菌感染巨噬细胞后会引起锌指蛋白A20的表达显著上调。A群链球菌作用于小鼠巨噬细胞，A20表达上调[7]。放线菌酮阻断小鼠巨噬细胞后再感染A群链球菌，A20表达明显降低，用TNFRR1抗体阻断小鼠巨噬细胞后再感染A群链球菌后，A20无表达，且MyD88基因敲除鼠的骨髓源巨噬细胞在A群链球菌的刺激下A20无表达。这说明A20表达部分依赖于TNFR1途径，且A群链球菌致巨噬细胞表达A20是MyD88途径依赖性的。锌指蛋白A20在化脓性链球菌复制和感染中起到很重要的作用，提示锌指蛋白A20可能参与调控细菌感染机体后发生的炎症反应过程，作为细菌在感染机体后在体内复制的一个重要信号分子。因此本次研究主要揭示细菌感染患者血清中锌指蛋白A20的表达效果，探讨锌指蛋白A20在细菌感染过程中的调控机制以及能否作为细菌感染时的一个信号分子。

1材料与方法

1.1 一般资料

本次研究对象选取重庆市黔江中心医院2022年3月-2022年10月经培养、鉴定以及药物敏感试验鉴定出的248例病原微生物感染的病人血清样本，其中男性102例，女性146例，患者年龄19-87岁，平均年龄（45±15）岁。血培养阳性经鉴定革兰阳性菌93例，其中以凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌为主；革兰阴性菌155例，其中以大肠埃希菌最为常见。选取健康体检80例作为对照组，男44例，女36例，年龄21-80岁，平均年龄（40±13）岁，排除患有感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、心血管、糖尿病等疾病。采血后6小时内进行离心，分离3mL血清于EP管中置于-80℃冰箱冷冻保存。

1.2 主要试剂和仪器

血清锌指蛋白A20检测采用江莱生物ELISA试剂盒Cat.#JL46124（上海将来实业股份有限公司），所用酶标分析仪是Thermo Scientificd的超微量微孔板分光光度计（型号：Multiskan Go），超低温冷藏储存箱（DW-HL388）中科美菱低温科技股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 检测前实验准备

1.3.1.1提前60分钟从超低温冰箱取出待检血清样本，进行充分解冻。

1.3.1.2实验前20分钟从冰箱取出锌指蛋白A20试剂盒，使其复温。

1.3.1.3 配制洗涤液：按照实验要求进行20倍洗涤缓冲液的稀释，即原倍洗涤液和蒸馏水按1:19进行稀释。

1.3.2 ELISA法检测血清锌指蛋白A20步骤

1.3.2.1从室温平衡60min后的试剂盒内铝箔袋中取出板条，将剩余板条密封好后放回4-8℃冰箱。

1.3.2.2 设置空白孔、标准孔和样品孔。空白孔不加，6个标准品孔分别加入156.25pg/ml、312.5 pg/ml、625 pg/ml、1250 pg/ml、5000 pg/ml的标准品各50 uL。

1.3.2.3 样品孔中加入待测血清样品50uL。

1.3.2.4 标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100uL（除空白孔外），用封膜板封住反应孔，放至37℃恒温箱温育一小时。

1.3.2.5弃去各孔内液体，用吸水纸拍干，每孔加稀释后的洗涤液（350uL），静置30秒，甩去洗涤液，再次用吸水纸拍干板条，如此重复5-10次。

1.3.2.6 每孔先加入底物液A 50μl，然后加入底物液B 50μl，37℃恒温箱避光孵育15min。

1.3.2.7 每孔加入50uL终止液，终止反应，15min内使用超微量微孔板分光光度计在450nm波长处测定各孔的吸光度值。

1.3.2.8 绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样本浓度。

1.4统计学处理

数据使用SPSS19.0软件（SPSS Inc，IL,USA）进行统计学分析，实验对象的生物学和临床特征以means(均值)±SD（标准差）表示，两两间比较使用Mann-Whitney检验，采用Spearman等级相关分析方法分析两变量之间的关联，P<0.01认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 健康对照组与病原微生物感染组血清锌指蛋白A20水平研究

80例健康对照与248例病原微生物感染患者间血清锌指蛋白A20浓度比较，细菌感染患者A20表达水平显著高于阴性对照组，具有统计学意义（P<0.01）,见图1

图1 健康对照和病原微生物感染患者血清锌指蛋白A20表达水平

2.2 健康对照与革兰阳性菌感染患者、革兰阴性感染菌患者血清锌指蛋白A20表达水平研究

为探究革兰阳性菌、革兰阴性菌菌感染患者血清锌指蛋白A20与健康对照组间血清A20之间表达有无差异，我们做了如图2、图3的研究，结果：革兰阳性菌感染组、革兰阴性菌感染组血清锌指蛋白A20水平均高于健康对照组（P<0.01）。

   图2.健康对照组和革兰阳性菌组血清锌指蛋白A20表达水平

  图3.健康对照组和革兰阴性菌组血清锌指蛋白A20表达水平

2.3 各例大肠埃希菌感染患者血清锌指蛋白A20表达水平研究

在革兰阴性菌血流感染患者中以大肠埃希菌为主，共55例，占35.5%，我们发现，大肠埃希菌组血清锌指蛋白A20浓度显著高于健康对照组（P<0.01），如图4所示。且大肠埃希菌组锌指蛋白A20浓度分布范围较宽，部分个例A20浓度处于较高水平。

图4.健康对照组和大肠埃希菌感染患者血清锌指蛋白A20表达水平

2.4 各例金黄色葡萄球菌感染患者和凝固酶阴性葡萄球菌感染患者A20表达水平研究

革兰阳性菌血流感染组中，以金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌为主，金黄色葡萄球菌感染15例，占16.1%，凝固酶阴性菌感染30例，占32.3%，结果发现，金黄色葡萄球菌感染组和凝固酶阴性葡萄球菌感染组血清锌指蛋白A20浓度均高于健康对照组（P<0.01），见图5。

图5.健康对照组、金黄色葡萄球菌感染组和凝固酶阴性葡萄球菌组血清锌指蛋白A20表达水平

3讨论

大多数细菌入侵机体后被巨噬细胞吞噬，革兰阳性菌或是革兰阴性菌，主要通过内毒素或外毒素、侵袭性酶等致病因子发挥致病作用，最终诱发宿主细胞发生程序性死亡。近年来，细菌感染与凋亡、自噬、焦亡、细胞程序性坏死的研究成为热点。在本次研究中发现A20在健康体检组和细菌感染患者之间的表达具有显著差异，细菌所产生的细菌毒素，如革兰阳性菌的外毒素、革兰阴性菌的内毒素等病原相关分子模式黏附于宿主细胞表面，被细胞的Toll样受体识别后，启动胞内多种信号途径，诱导炎症细胞发生炎性反应，而A20作为一种负向炎症调控蛋白，A20表达水平上调说明A20参与了细菌入侵宿主后的炎症调控过程。A20在以往大量研究中被证实为负向炎症调控因子，能够将NF-κB(nuclear factor-kappa B)信号转导通路中的多种蛋白,如肿瘤坏死因子相关作用蛋白(RIP)、肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、核因子κB抑制蛋白激酶γ(IKKγ)发生泛素化,抑制上述几种蛋白被相应蛋白酶降解，进而反馈调节NF-κB信号通路。A20基因缺失实验间接地证实了A20在抵抗炎症发挥的重要性。特异性敲除B淋巴细胞中A20基因的大鼠可发生严重的狼疮肾炎，并伴有B细胞的大量增殖和自身抗体的产生[8]。髓样细胞中A20基因缺失的大鼠会在一段时间后出现四肢红肿现象，在免疫组化中显示这些大鼠的关节滑膜中有大量炎症细胞浸润，表现出类风湿关节炎的症状[9]。有研究[10]发现A20基因缺失使肿瘤细胞对弥漫大B细胞淋巴瘤的化疗效果造成影响。弥漫大B细胞淋巴瘤中A20基因的缺失会下调A20蛋白的表达，锌指蛋白A20表达下调会导致其对NF-κB的负调节作用有所下降,使得肿瘤细胞内NF-κB信号通路处于持续活化状态,增强蛋白P-gp/p65的表达。

本次实验分析中发现，革兰阳性菌感染组血清中锌指蛋白A20总体表达水平和革兰阴性菌感染组A20总体表达水平分别与健康对照组相比较，均具有明显差异，血清锌指蛋白A20含量在革兰阳性菌感染或革兰阴性菌感染时都上调，初步提示A20在细菌感染中扮演了某一种角色,具有一定的作用。革兰阴性菌的外膜成分脂多糖（LPS）、革兰阳性菌的细胞壁成分肽聚糖（PGN）和磷壁酸被Toll样受体识别后，介导细菌跨膜信号转导以及下游信号途径的激活。如LPS与TLR4和MD2在细胞表面形成复合物后激活下游信号NF-κB，刺激白介素、TNF-α等炎性因子转录表达。在革兰阳性菌和革兰阴性菌所致的血流感染早期鉴别诊断中，一些炎性反应标志物能够在鉴别分析中起到一定作用。郝玉清等

[11]研究发现革兰阳性菌感染组和革兰阴性菌感染组除了炎症相关细胞因子PCT、IL-1β、IL-6外，炎症相关急性时相蛋白NGAL、SAA、HPT、hs-CRP，氧化应激介质MDA 、AOPP、TAC、CAT、SOD含量同样有显著差异。外周血单个核细胞TLR4 mRNA和PCT联合检测可进一步提高脓毒症的诊断效能，为临床诊断提供重要的参考价值[12]。周丹等[13]研究得出血清分化因子15（GDF15）、未成熟粒细胞(IG)可作为预测老年危重症患者发生血流感染的生物标志物。王青等[14]发现在患者发生输血相关性急性肺损伤与A20呈明显正相关。A20发挥生物效应时依赖其双重酶作用介导发生炎症反应时胞内多种信号通路相关信号分子，从而抑制TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子的表达，A20在细菌感染时表达明显上调，这是否提示了A20通过某些机制调控了炎症相关因子在革兰阳性菌感染和革兰阴性菌感染时的不同表达，或许与细菌的细胞壁、信号转导受体以及相应靶细胞有关。

进一步分析发现革兰阳性菌感染组中的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，革兰阴性菌感染组中的大肠埃希菌血清A20平均浓度均高于健康对照组，且三种细菌类型中锌指蛋白A20浓度分布范围宽，部分个例A20处于异常的高浓度水平，即使是同一属种细菌感染，不同个例血清A20的浓度水平差异较大。由于国内对抗生素的使用过于广泛，使得细菌的耐药性愈加明显，细菌的致病性与毒力因子有关，同一种细菌不同菌株之间所携带毒力基因的类型和数量不一，菌株所表现出来的耐药性情况有所差异。造成A20在同一细菌感染组表达水平差异化的原因就有可能跟细菌的基因型、耐药性、菌株不同有关，也可能与疾病的发展过程，临床治疗有关。

综上所述，我们实验研究发现血流感染时血清锌指蛋白A20表达上调，在细菌感染和复制中发挥重要作用，这些结果为研究锌指蛋白A20在细菌感染过程中的发生机制和调控机制提供新的思路，也将成为我们下一步实验研究方向。

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