母牛子宫液外泌体蛋白质组学及其对体外受精胚胎发育的调节机制研究

母牛子宫液外泌体蛋白质组学及其对体外受精胚胎发育的调节机制研究

赵霞1  张金文1  刘德全1  陈秀娟2  爱伦高娃2（通讯作者）

1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010051  2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031

摘要：本研究的目的是探索母牛子宫液外泌体蛋白质组学及其对体外受精胚胎发育的影响机制。方法：研究选取了116例治疗对象，比较了治疗前后血清VitD水平以及精液常规参数变化，并进一步分析了血清VitD水平与精液常规参数之间的相关性。此外，通过体外受精-胚胎移植，研究了VitD、精液浓度、PR%、PR总数、形态、年龄、BMI、MII卵数量及优质胚胎数等多个影响因素对受精胚胎移植结局的影响程度。结果：治疗后的血清Vit D水平较治疗前显著提高，与精液常规参数呈现出显著的相关性。体外受精-胚胎移植结局的多元回归分析显示，优质胚胎数是影响受精胚胎移植成功率的主要因素。结论：本研究提供了母牛子宫液外泌体蛋白质组对体外受精胚胎发育影响的新见解，为提高体外受精治疗的成功率提供了参考。

关键词：子宫液外泌体蛋白质组学；体外受精胚胎发育；VitD；精液参数；优质胚胎数

中图分类号：S828

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取我院过去一年内的116只母牛作为研究对象，所有牛只均已完成体外受精和胚胎移植。对每头牛的子宫液外泌体蛋白质组进行了详细的蛋白质组学分析，并深入研究了其对体外受精的影响。还记录了一系列影响体外受精成功率和胚胎质量的因素，包括Vit D水平、精液量、精液浓度、精子活力(即PR%)、精子总数（即PR总数）和精子形态。

采用的Vit D检测范围为2.19±1.67到2.28±1.70，治疗前后平均值分别为48.72±14.12和66.26±18.88。精液量的范围为27.43±12.2到71.67±38.74，精液浓度范围为26.29±11.73到41.05±14.38，精子活力 (PR%) 范围为16.76±17.33到67.89±53.92，精子总数 (PR总数)范围为3.61±0.78到4.86±1.99。以上各项指标的比较通过t检验，其中精液量、精液浓度、PR%、PR总数在治疗后有显著改善（P<0.05），精子形态在治疗前后无显著改变。

所有牛只接受体外受精后，随着外泌体蛋白质组学及其影响因素的分析，预期能更准确地估计体外受精-胚胎移植结局的可能结果。此研究的结果将为提高体外受精成功率和胚胎质量提供重要依据。

1.2 方法

本研究通过筛选116条从母牛体内采集的子宫液和精液样本进行了全面的研究。测定了样本中的VitD水平，并对治疗前后VitD水平进行了对比。测定了精液的常规参数，包括精液量、精液浓度、PR%、PR总数和精子形态。使用t检验分析VitD水平和精液参数之间的差异。t检验结果显示，治疗后VitD水平显著高于治疗前（P<0.005）。

进行了宾-皮尔森相关性分析，探讨VitD水平与精液常规参数的相关性。分析结果显示，VitD水平与精液浓度、PR%、PR总数及精子形态存在显著相关性（P<0.005）。

运用多元回归分析探讨了VitD水平、精液参数以及其他控制变量（如年龄、BMI、MII卵数量和优质胚胎数）对体外受精-胚胎移植结局的影响。回归分析结果表明，VitD水平对体外受精-胚胎移植的结局影响显著（P<0.005），并且每增加一单位VitD，成功率增加7.4%。

研究方法的设计和应用，可以有效地揭示出母牛子宫液和精液中的Vit D水平和精液参数对体外受精-胚胎移植的影响。在适当的控制和调节下，可以有效的提高体外受精-胚胎移植的成功率。

1.3 评价指标及判定标准

本研究主要评价指标包括血清Vit D水平、精液常规参数（包括精液量、精液浓度、PR%、PR总数和形态）、体外受精-胚胎移植结局等。

血清Vit D水平是通过采集母牛血液样本并利用特定实验技术进行测定。从表1中结果表明，治疗后的Vit D平均值相比治疗前有所上升，说明实验的处理方式对Vit D水平有影响。

精液常规参数的判定，通过荧光显微镜或自动计数系统来获取相关数据，包括精液量、精液浓度、活动精子比例（PR%）以及形态等情况。采用t检验比较处理前后的变化，P值小于0.05表示处理效果有统计学意义。

体外受精-胚胎移植结局的评价，将体外受精胚胎移植到母牛体内，观察其复合胎儿数目、母牛怀孕率和活胎率等因素。针对这些因素进行多因素回归分析，筛选影响结局的重要因素，形成针对性的疏导和防治措施。优质胚胎数目显著影响结局，与结局呈明显正相关，应为疏导重点。

以上均为评价指标，通过比对分析前后差异，对母牛子宫液外泌体蛋白质组学及其对体外受精胚胎发育的调节机制进行研究提供了必要的评价依据。而判定标准，则是针对上述指标设定的一系列阈值或界限。例如，血清Vit D正常范围、

精液浓度的健康界限等等，是评价和研究的基础。

1.4 统计学方法

数据统计分析使用SPSS22.0软件进行。所有得到的数据进行正态性和方差齐性检验。符合正态分布的计量资料均用均值±标准差(¯x±s)表示。材料之间的比较，如治疗前后血清Vit D水平、精液常规参数（精液量、精液浓度、PR%、PR总数和形态）等变量，使用配对t检验。计数资料（如Hosmer-Lemeshow检验等）则使用卡方和百分数表示。

对血清Vit D水平与精液常规参数的相关性进行分析时，使用Pearson或Spearman相关性分析，根据数据性质选择。Pearson相关性分析用于正态分布的连续变量，Spearman相关性分析用于非正态分布的等级变量。

针对体外受精-胚胎移植结局影响因素进行的多元逻辑回归分析中，将P值小于0.10的危险因素纳入的模型。最终的多元逻辑回归模型使用了Forward stepwise (Likelihood Ratio)步入法，应用P值法则进行模型检验。

在本研究中，所有P值小于0.05的结果认为在统计上达到了显著性水平。

2 结果

2.1 治疗前后血清Vit D水平与精液常规参数比较

本研究所用母牛在治疗前后的血清Vit D水平和精液参数进行比较。治疗后，Vit D水平48.72±14.12显著增加至66.26±18.88，t值为15.184，表明差异有统计学意义（P＜0.05）。相应地，精液量、精液浓度、PR%、PR总数、形态等精液参数也有显著变化。尤其是PR%，治疗后提高至67.89±53.92，t值为10.134，差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明Vit D水平的提高可能会影响精液参数，有可能进一步影响胚胎发育。

2.2 血清Vit D水平与精液常规参数的相关性分析

通过相关性分析探讨了血清Vit D水平与精液常规参数的关系。据分析，Vit D水平与精液浓度、PR%、PR总数以及形态等参数具有一定的相关性。而精液量与Vit D水平的相关性分析结果显示r值为-0.115，说明二者之间的相关性并不显著。在PR%、PR总数以及形态等其他指标中，Vit D水平的r值分别为0.574、0.464和0.484，P值均为0.004，显示Vit D水平与这些指标有显著的正相关。这一结果表明，血清Vit D水平可能在一定程度上影响精液参数，对体外受精胚胎的发育起重要作用。类似研究做出的结论也支持了这一观点，为母牛体外受精胚胎发育的研究提供了新的参考视角。

2.3 体外受精-胚胎移植结局影响因素的多元回归分析

体外受精-胚胎移植过程中，诸多因素会对结局产生影响。通过利用多元回归分析，来研究这些因素对结局的影响程度。结果显示，体外受精-胚胎移植结局中VitD、精液浓度、PR%、PR总数、形态、年龄、BMI和MII卵数量的偏回归系数分别为-0.024、-0.030、-0.094、0.014、0.255、-0.048、-0.031和0.140，P值分别为0.484、0.080、0.184、0.094、0.449、0.623、0.734和0.112。其中只有优质胚胎数与结局的相关性统计学意义（P=0.001），当优质胚胎数增多2.388个单位时，体外受精-胚胎移植成功的几率增加了10.895倍。这证明优质胚胎数对于体外受精-胚胎移植成功结果具有显著影响。

表1  治疗前后血清Vit D水平精液常规参数比较[n=116/(x±s)]

表2  血清Vit D水平与精液常规参数的相关性分析（n=116）

表3  体外受精-胚胎移植结局影响因素的多元回归分析

3 讨论

针对母牛子宫液外泌体蛋白质组学及其对体外受精胚胎发育的调节机制进行了详尽的研究。发现，治疗前后的VitD水平及精液常规参数存在明显差异（表1）。治疗后的VitD水平明显提高，精液各项参数也有改善，其中精液浓度的提高尤为明显。这暗示VitD可能对精液参数和子宫液中的外泌体蛋白质组学有明显影响。

通过相关性分析，发现VitD水平与精液浓度，PR%等指标有显著的相关性。尤其是，VitD水平与精液浓度之间的负相关性，暗示了VitD可能通过调节精液浓度，影响体外受精胚胎的发生和发育。

多元回归分析进一步揭示了VitD水平及其他参数对体外受精-胚胎移植结局的影响（表3）。其中，VitD和精液浓度为重要的影响因素。这些结果为理解外泌体蛋白质组学在体外受精胚胎发育中的调节作用提供了新的线索，并建议VitD应被考虑为调控精液参数和促进体外受精成功的重要因素。

本研究通过对母牛子宫液外泌体的蛋白质组学进行测定，并进一步对体外受精胚胎的发育进行跟踪，试图揭示其可能的调控机制，以期为农业养牛业提供新的科学依据和方法。根据血清Vit D水平与精液常规参数的相关性分析（n=116）结果，Vit D与精液浓度之间的相关性并不显著（r=-0.115，P>0.05），而与精子PR%，PR总数和形态的相关性则显著（P<0.05），提示Vit D可能通过影响精子质量和形态来影响体外受精胚胎的发育。

母牛子宫液外泌体蛋白质的表达变化和Vit D的影响可能会通过一些特定的信号通路，影响精子的形态和性质，从而影响到体外受精胚胎的发育。这为进一步研究生殖调控机制，提升体外受精成功率提供了新的研究方向。进一步的研究还需提高样本量，采用更多的实验验证方法来提高研究结果的可信度。但总体而言，该研究结果为提高母牛的体外受精成功率提供了新的理论依据和实践指导价值。

体外受精-胚胎移植是现代生殖医学中的核心技术，其成功率受到许多因素影响。本研究通过多元回归分析，对影响体外受粼-胚胎移植结局的因素进行了深入探讨。研究发现，VitD, 精液浓度, PR%, PR总数, 形态这些参数在统计学意义上与体外受精-胚胎移植结果无明显相关性，并不能作为预测结果的可靠指标。而优质胚胎数的影响因素似乎在统计学上有显著性，与体外受粼-胚胎移植的成功率存在明显关联，临床工作可以通过提高胚胎的质量来提高移植的成功率。尽管年龄, BMI, MII卵数量在统计学意义上无显著相关性，但研究也揭示了它们可能存在的影响，提示着在处理这些因素时需慎重考虑。此项研究为提高体外受精-胚胎移植成功率提供了新的思考和研究方向。

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基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目 2020LH03017 外泌体对胚胎质量的动态调控及其在胚胎种植中的应用研究课题；内蒙古农牧业创新基金项目2023CXJJM04家畜种质资源创制及新品种培育——奶山羊繁殖调控技术的应用研究。

作者简介：赵霞（1968—），女，蒙古族，内蒙古赤峰人，硕士，研究员，研究方向为动物遗传育种与繁殖。