菌-农家肥的复合肥对生产生菜土壤细菌多样性的影响

菌-农家肥的复合肥对生产生菜土壤细菌多样性的影响

吴艳林 张贺 许越众 张学芬 高桂凤*

吉林农业科技学院农学院 吉林 132101

摘要：为了研究巨大芽孢杆菌、5406放线菌、枯草芽孢杆菌与农家肥制成的复合肥对生产生菜土壤细菌群落多样性的影响。本试验以生产生菜为依托，设置了3个处理，分别为A、B、C（对照组），生菜收货后，取土样送到北京百迈客生物科技有限公司进行细菌多样性测定。结果知道：样本A、B内菌种丰富度和均匀度要比样本C高，尤其，样本B内菌种丰富度及多样性比样本C差异显著（P˂0.05）。

关键词：复合肥；细菌多样性；丰富度；均匀度

分类号：S154.3；Q939.96

Effect of compound fertilizer of bacteria-farm manure on bacterial persity of soil for lettuce production

Wu Yanlin Zhang He Xu Yuezhong Zhang Xuefen Gao Guifeng*

College of Agriculture, Jilin University of Agricultural Science and Technology  Ji Lin. 132101

Abstract:In order to study the effects of compound fertilizer made of Bacillus gigantilis, actinomyces 5406, Bacillus subtilis and farm manure on the persity of soil bacterial community in lettuce production.This experiment was based on the production of lettuce, and three treatments were set up, namely A, B and C (control group). After receiving the lettuce, soil samples were sent to Beijing Baimaike Biotechnology Co., Ltd. for bacterial persity determination.The results showed that the abundance and uniformity of bacteria in samples A and B were higher than that in sample C, In particular, the abundance and persity of bacteria in sample B were significantly different from that in sample C（P˂0.05）.

Keyword:Compound fertilizer; Bacterial persity; Richness; evenness

黑土地是大自然赋予人类的瑰宝，是一种土壤肥力高、适宜植物生长的土壤资源。黑土地主要位于我国东北平原地区，它是我国最重要的商品粮基地，黑土地质量的优劣直接影响国家粮食安全。随着长期不合理的开发利用，黑土地耕地

出现了各种问题，如土壤有机质含量降低、土壤板结、养分失衡、含水量低、结 构不合理、保水保肥能力降低，土壤的理化性及生态功能等方面都有退化，及时加以保护更有其急迫性。其中，在种植业上施用生物肥料对于保护黑土地具有非常重要的长远意义。

 巨大芽孢杆菌具有解磷功能[1-4]，5406放线菌既能增加土壤养分, 还能产生一些激素类及维生素类物质[5],枯草芽孢杆菌的生长能产生枯草菌素、多粘菌素等活性物质，对致病菌等条件致病菌有明显抑制作用等[6]。农家肥含有丰富的有机物，通过发酵腐熟对于培肥地力具有一定作用。

本试验利用巨大芽孢杆菌、5406放线菌、枯草芽孢杆菌与农家肥制成生物肥料[7]，然后用该复合肥生产生菜，收货后研究生菜地各处理土壤细菌多样性，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料与试验地点

供试农家肥原料取自农家动物干粪便，并发酵腐熟。生物肥料所用菌种为自制巨大芽孢杆菌、5406放线菌和枯草芽孢杆菌。供试作物选用全年耐抽薹生菜（意大利生菜）。供试土壤取自吉林农业科技学院园艺场温室大棚。

1.2 试验设计与处理

采用整地施肥做畦，将其划分为三份，一份空白组，一份施入农家肥，一份施入菌-农家肥，结合翻地坐畦施入，畦宽1.2-1.3米，高10-12厘米。试验周期为2023年6-11月。控制各施肥量一致，设置3个处理组，A 组：施用加入巨大芽孢杆菌、5406放线菌、枯草芽孢杆菌的农家肥。 B组：施用未加菌的农家肥。C 组：空白组。不施农家肥。生菜生长40 d后收获，并随即对每个处理组随机采集表层0~20 cm土壤样品，将采集的土壤样本保存在2 mL无菌离心管中，用冰袋冷冻送往北京百迈客生物科技有限公司进行细菌多样性测定。

1.3克隆土样中细菌菌种16SrRNA基因高变区V3+V4的基因序列

共三个处理，每个处理重复3次，取9个样本送达北京百迈客生物科技有限公司，用引物F：ACTCCTACGGGAG GCA;R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT克隆土样细菌16SrRNA基因高变区V3+V4的基因序列。然后用统计学方法整理分析样本内细菌菌种多样性。

1.3.1样本内菌种基因序列长度大小分类整理

由于不同菌种基因序列长度可能相同，可能不同，将所有克隆的基因序列根据大小分成若干组，除了第一组是（0-350)外，其它组的组距都是10，下面列出其它组分别为[350-360)[360-370)[370-380[380-390)[390-400)[400-410) [410-420) [430-440)[440-450)[450-460)[460-470)等，然后用统计学方法计数各个组序列read counts，然后用横坐标表示序列的组距，纵坐标表示read counts，制作柱形图。

1.3.2样本间菌种丰富度及物种多样性差异显著性的检验

为了了解不同样本间菌种丰富度及多样性差异显著性，用Shannon、PD whole tree法进行分析，用Shannon分析时，同种菌种丰富度，若群落中各菌种均匀度越大，则认为群落的多样性就越大，指数值越大，说明样品的菌种多样性越高[8]。用PD_whole_tree分析时，它用各个样品中OTUs 的代表序列构建出系统发育树的距离，将某一个样品中的所有代表序列的枝长加和，从而得到的数值。 数值越大，群落多样性越高。

本试验将各组的样本的数据绘制成箱线图，以直观地展示不同样本之间的alpha多样性差异，默认通过Student t 检验，验证差异的显著性。横坐标为样本名称，纵坐标为相应指数的值。柱子间的连线上的数字为T检验的P值(若P值＞0.05 则默认不显示P值)。

1.3.3 等级丰度曲线的制作

等级丰度曲线[9]是将各样本的 特征丰度按大小排序并基于其相对丰度绘制的曲线图，主要用于同时解释样本所含菌种的丰富度和均匀度，菌种的丰富度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示菌种的组成越丰富；菌种组成的均匀度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示菌种组成的均匀程度越高，每条曲线对应一个样品，用不同颜色标记。横坐标为按特征丰度排序的序号，纵坐标为对应的特征的相对丰度。

1.3.4样本内在纲、科、属、种水平菌种所占相对丰度比例统计

本试验主要研究纲、科、属、种水平的细菌菌种多样性分布情况。菌种分布柱状图：从左至右、从上至下依次为纲、科、属、种水平；一种颜色代表一个菌种，色块长度（柱状图）表示所占相对丰度比例；为使视图效果最佳，只显示丰度水平前十的物种，并将其他菌种合并为 Others 在图中显示，Unclassified代表未得到分类学注释的菌种。横坐标表示分组情况，纵坐标表示菌种的相对丰度。

 1.3.5菌种进化树的样本群落分布图制作

挑选出OTU/ASV分类学水平上 Top80丰度比例的特征序列，用QIIME命令行进行多重序列比对并构建系统进化树，然后结合系统进化树和菌种分类丰度的数据，使用R包 ggtreeExtra 进行可视化，以菌种环状进化树及柱状图的形式展示，可以获取：（1）菌种之间的进化关系；（2）不同样本之间的菌种相对丰度比例信息等信息。环形图为菌种进化树，相同颜色菌种名（展示准确注释到的分类物种名和对应的Feature ID）代表所属于相同的门。

2 结果与分析

2.1样品内菌种基因序列长度大小统计结果分析

图1 样本A、B、C内菌种基因序列长度分布图

注：图从左至右分别为样本A、B、C

通过统计发现：无论是对照组（样本C）还是样本A、B，基因的序列长度在[400-410)([410-420)[430-440)[440-450)之间分布的居多，尤其，在[400-410)和[440-450)区段最多，而在其它区段样本A和B的总数要明显高于对照组。

2.2样本间菌种丰富度及菌种多样性差异显著性的检验结果分析

用Shannon、PD whole tree法进行了检验 （见图2），从图2可以知道，样本A和样本B指数值比样本C大，说明样本A和B土壤中菌落多样性要比样本C高。Shannon、PD whole tree指数法检测结果发现：样本B和C之间P˂0.05，说明两个样本之间菌种群落多样性差异显著，在样本A和C之间没有发现差异显著性，但在直接观察发现A和C之间相差很大，但没有达到显著水平。因此，这样的试验设计是比较正确的。

图2 Alpha多样性指数样本间差异相线图

2.3样本内菌种丰度和均匀度分析

通过制作等级丰度曲线可以知道（见图2），样本A和B曲线的宽度和平坦度接近，并且比样本C明显的宽而平坦。说明样本A和B内菌种的组成比较丰富，并且A和B样品内各菌种组成的均匀度比样本C高。

图3 样品Rank-Abundance曲线图

2.4在样本内纲、科、属、种水平的菌种所占相对丰度比例统计结果分析

从纲水平菌种相对丰度分布图可以发现，Gammaproteobacteria和Saccharimonadia在三个样本的土壤中都比较丰富，并且丰度相似；对照组只有3个门的菌种相对比较丰富外，其它菌种与样本A、B比较要少很多，特别是Others要少得更多。从属和种水平的物种相对丰度分布图可以发现unclassified_LWQ8、Luteibacter、unclassified_Gammaproteobacteria、unclassified_Saccharimonadales、unclassified_Cyanobacteriales、Chujaibacter、TM7a丰度相似，其它菌种无论是菌种多样性上还是菌种均匀度上样本A和B都比对照组高，其中样本B内的菌种多样性上要高于样本A。

图4.1纲水平上菌种相对丰度比例  图4.2科水平上菌种相对丰度比例

图4.3属水平上菌种相对丰度比例  图4.4种水平上菌种相对丰度比例

2.5菌种进化树的样本群落分析

从系统进化树知道，这三个样本中属于Proteobacteria门的菌种几乎占50%，其次是Patescibacteria门，而unclassified_Bacteria门和Planctomycetota门只发现了一个分支。另外还发现在进化树内几个门中少数分支在三个样本内分布严重不均匀，如Proteobacteria门中的g__Chujaibacter只在样品C中发现，Proteobacteria门中的f__Comamonadaceae、s__Limnobacter_litoralis和Bacteroidota门中的s__Pedobacter_sp._b3N1b_b5在样品C中占比例非常大；Cyanobacteria门中的o__Cyanobacteriales和Actinobacteriota门中的g__Arthrobacter在样品A中含量非常丰富。从菌种分布情况可以知道，土壤环境的不同对一些菌种的分布是有影响的。

图5 物种进化树的样本群落分布图

注：右上角图例为门水平菌名称, 内圈为物种进化树，内圈菌种中同一个门显示同一个颜色；外圈表示该菌种在不同样本中的相对丰度占比。

3.讨论

从样本菌种基因序列长度分布知道，样本A、B多样性高于样本C，样本A优于样本B；用PD whole tree和Shannon指数法检测样本间细菌种丰富度及多样性的差异显著性知道，样本B和C之间菌种多样性差异显著，在样本A和C之间没有检测到差异显著性，但直观观察看到，样本A菌种多样性比样本C高。另外，无论是对样本内菌种的丰富度和均匀度分布还是对样本内在纲、科、属、种水平各菌种所占相对丰度比例分析知道，样本A、B丰富度和均匀度都要比样本C高，尤其，样本B更高。分析原因可能是样本A中添加了5406放线菌和枯草芽孢杆菌，它产生一些抑菌物质抑制了一些菌的生长的结果，以期待以后进一步研究。这为以后根据研究目的如何使用5406放线菌和枯草芽孢杆菌应用在生产上奠定了理论基础。

参考文献

[1]高桂凤，党博，蔡柯，等.1株解磷菌鉴定及影响其解磷能力因素[J].东北林业大学学报，2020，48（1）：102-104.

[2]金术超，杜春梅，平文祥，等.解磷微生物的研究进展[J].微生物学杂志，2006，26（2）：73-78.

[3]SON H J，PARK G T，CHA M S，et al. Solubilization of insoluble inorganic phosphates by a novel salt-and pH tolerant Pantoea agglomerans R-42 isolated from soybean rhizosphere[J]. Bioresource Technoloogy,2006,97:204-210.

[4]鲍明，许章峰.巨大芽孢杆菌在生物肥料上的研究现状与发展方向[J].农技服务，2013，30(6):601- 602

[5]孙于淼,吴慧玲,张涛涛,等.5406 放线菌对西瓜的促生作用及对西瓜枯萎病的防控[J].科学技术与工程,2021,21(15):06242 -07

[6]胡亚杰,韦建玉,卢健,等.枯草芽孢杆菌在农作物生产上的应用研究进展[J].作物研究,2019,33(2):167 -172

[7]阎佩云,吴月,贾小卫.不同施肥处理对春季生菜土壤酶活性的影响[J].陕西农业科学,2022,68(08):76-79.

[8] Grice EA, Kong HH, et al. (2009). Topographical and temporal persity of the human skin microbiome. Science, 324(5931): 1190–1192.

[9] Kõljalg U, Nilsson RH, et al. : Towards a unified paradigm for sequence‐based identification of fungi. Molecular Ecology 2013, 22(21):5271-5277.

吉林省大学生科技创新创业训练计划项目（S202311439006）

第一作者简介:吴艳林,女,2001年12月，吉林农业科技学院农学院本科生

通信作者:高桂凤（1971-）,女，讲师,研究方向：微生物