制药用水微生物检测与控制研究

 制药用水微生物检测与控制研究

陈彩萍

海南普利制药股份有限公司  海南省海口市  570100

摘要：水是制药工业的重要资源，具有原料溶解、反应介质、清洗冷却等多个环节。但是水环境中存在着许多与水有关的问题，其中最重要的就是水环境中微生物的存在与繁殖。水体中微生物的存在不仅会影响药品的品质与功效，而且会对生产环境及员工的健康造成潜在的危害。因此对制药用水进行微生物检测和控制具有重要意义。笔者本篇文章意在探究制药用水的微生物检测和控制方法，意在为制药用水质量的提高提供助力。

关键词：制药用水；微生物检测；控制研究

微生物检验至关重要，尤其是在制药过程中，如果水体中存在大量的微生物，将会影响药品的品质与稳定性，造成产品的变质、失效。尤其对注射剂而言，微生物污染对患者健康构成了很大威胁。因此建立一套行之有效的微生物检测与监控系统，对于保证药品质量与生产安全具有重要意义。

一、膜过滤法

膜过滤技术的核心是采用聚碳酸酯或聚硫酸纤维，其孔径一般在0.22~0.45μ m之间，可以有效地截留大部分的细菌和病毒，当水通过滤膜时，微生物会被截留在滤膜表面，水、无机盐等小分子会通过滤膜，将滤膜转移至营养介质中，为被截留的微生物提供适宜的生长环境，使其在培养基中生长。在实际应用时，应根据检测目的及水样的性质，选用适当的滤膜及培养基，制药用水一般选用0.22μ m的滤膜，以及适宜于多种微生物生长的富营养介质，在前处理过程中，为了保证检测结果的准确性，需要对样品进行适当的处理，如调节 pH值、温度和去除抑制剂等[1]。需要用滤膜过滤设备对水样进行过滤，这一过程可由人工或自动装置完成，滤过之后，小心地把滤过的滤膜移至已备好的培养皿中，此步骤必须在无菌条件下完成，以防止污染，然后将培养皿置于恒温培养箱中，一般于35~37℃的环境下，培养24~48小时。孵育一段时间后，将培养皿中的菌落计数取下，此步骤需借助于显微镜、计数器等仪器，对生长良好且分散的菌落进行计数，所得菌落数量可反映水样中微生物的数量，对于检测结果，应按照制药业的有关标准对水样进行评价，以判定其是否满足制药用水微生物限度的要求。

二、荧光标记法

   荧光标记技术的基本原理是利用荧光染料对特定组分进行特异性识别，使其在特定波长的光照下发光，这一特点可用于荧光显微镜或流式细胞术精确计数。选择荧光染料的关键是在保持微生物活性的前提下，使荧光信号稳定、可检测。

在制药用水微生物检测中，采用荧光标记方法，需采集待测药品用水样品，必要时可适当稀释[2]。选用适当的荧光染料标记水中的微生物，这一步需要保证染料在不影响其生理状态的情况下，特异性地结合到靶微生物上，常用的荧光染料有 DAPI （DAPI）、可特异结合蛋白（FITC）等。处理后的样品在荧光显微镜下或流式细胞术检测，通过对荧光信号的分析，可准确地计算样品中微生物的数量。

在此基础上，对制药废水中微生物的污染情况进行了分析，以指导水质控制及改善。

三、ATP生物发光法

    ATP生物发光技术的原理很简单，但却很有效，ATP和某种酶发生反应，产生光量子，这一过程涉及两个主要成分，萤火虫荧光素酶和荧光素。当 ATP、萤光素及萤光素在适当的条件下，可发生化学反应，产生发光量子，通过测量发光强度，可准确推断样本中 ATP含量，从而评价水体中微生物活动程度[3]。实践中， ATP生物发光法需要从水样本中提取 ATP，这通常是通过加入特殊设计的提取剂，使微生物细胞壁破裂并释放 ATP，然后用荧光素及萤光素酶对 ATP进行混合。这一步需要在一定的条件下完成，才能保证反应的顺利进行。最后用一种特殊的检测设备——生物发光计来测量由化学反应引起的光强，利用光强测量与分析方法，可快速获取水体中微生物活性的精确数据。ATP生物发光技术具有快速、灵敏等优点，传统的细菌培养方法需要几天的时间才能出结果，而 ATP生物发光法可以在数分钟之内给出准确的检测结果，这一快速响应特性是其广泛应用于制药工业领域的关键所在，尤其是在对水质控制水平要求较高时。

四、聚合酶链反应（PCR）技术

PCR技术是以 DNA复制原理为基础，采用双特异引物、DNA模板、 DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸（dNTPs)，实现对特定 DNA片段的快速扩增，该工艺主要由三个阶段组成：变性、退火、拉伸。双链 DNA在高温下变性为单链，然后将温度降低，使引物结合到它的特异靶序列上；在合适的温度条件下，DNA聚合酶沿着模板 DNA形成新的 DNA链，经过这三步循环， DNA的数目成倍增加。PCR技术在医药用水微生物检测方面有着无可比拟的优越性，传统的微生物检测方法主要依靠人工培养，费时费力，且对难培养的微生物缺乏有效的检测手段，与之相比，聚合酶链反应（PCR）技术可以在数小时之内就能检测到特定微生物 DNA，极大地提高了检测的效率和准确度[4]

。在使用过程中，必须提取制药用水中的微生物 DNA，这一步通常包括采样、过滤、细胞溶解等步骤，以富集水体中的微生物并释放它们的 DNA。需要设计一对引物，以待测微生物的 DNA序列为引物，引物设计是决定 PCR反应特异性和敏感性的关键，引物一般是根据已有的微生物基因序列数据库进行设计的。采用 PCR扩增技术，将 DNA与设计好的引物、 DNA聚合酶及 dNTPs混合，经多次恒温循环后，实现特定 DNA片段的快速扩增。PCR产物经凝胶电泳分析后，可通过观察 DNA条带的大小来判断样品中有无目标微生物，同时采用荧光定量 PCR （qPCR）技术，实现对样品中微生物含量的实时监测。

结束语

综上所述，制药用水中微生物的检测和控制对于保证制药生产过程的安全性和质量具有重要意义，采用先进的检测技术与严格的控制措施，实现对水源中微生物含量的有效监控与控制，能够避免因微生物污染而影响药品生产及产品质量，同时持续地监测与评价，有助于制药企业及时发现可能存在的微生物污染，进一步保证药品的安全性。因此加强制药用水微生物的检测和控制，既是制药行业质量管理规范的需要，也是提高医药产业整体水平和保障公众健康的重要措施。

参考文献

[1]李明斌.制药工程纯化水系统在线检测控制分析[J].设备管理与维修,2023,(05):131-133.

[2]张帆,刘福利,董武军.国内外监管机构对制药用水质量控制的要点分析[J].药物评价研究,2023,46(01):19-23.

[3]通过在线分析降低制药用水微生物风险[J].流程工业,2021,(12):38-39.

[4]赵荣梅,蔡阳,李海芳.制药用水电导率的测量不确定度评定[J].应用化工,2021,50(S2):408-410.