农杆菌介导的番茄遗传转化体系建立

农杆菌介导的番茄遗传转化体系建立

杨丽莉

云南技师学院（云南工贸职业技术学院）

摘要：农杆菌介导的遗传转化受基因型、转化受体、菌液浓度和侵染时间、预培养、筛选剂、转化体的筛选和鉴定等多方面因素的影响。本文旨在通过分析侵染时间、预培养、共培养、筛选压等因素对农杆菌介导的番茄遗传转化的影响，建立理想的番茄遗传转化体系。

关键字：农杆菌；遗传转化；转基因植株；番茄

农杆菌介导的遗传转化是目前应用最广泛的遗传转化方法。影响农杆菌介导的番茄遗传转化因素主要有：（1）基因型：转化频率与植物基因型具有很大关系，即使在转化频率比较高的植物中（如马铃薯、烟草、拟南芥等）也有很大的基因型依赖性。这主要是由于不同基因型对农杆菌的敏感程度不同而引起的（梁美霞等，2004）。张赛群（1999）研究发现不同品种间转化频率有很大差别，实验中品种A57的转化率高达11.70%，而A10的转化率仅为1.10%。（2）转化受体：转化受体通常来自于植物的原生质体及外植体组织。外植体组织包括子叶柄、子叶、下胚轴、茎段等。Plastira等（1997）与欧阳波等（2002）报道番茄下胚轴是良好的转化受体,试验中采用番茄下胚轴作为外源基因的转化受体，表现出一些优势，如：下胚轴的再生比子叶要快，转化后再生芽的出现一般比子叶要早一两周。而王慧中等（1995）用番茄下胚轴和子叶进行遗传转化时发现，子叶的转化率比下胚轴高，子叶的转化率为35.24%，下胚轴为33.67%。（3）菌液浓度和侵染时间：菌液浓度和侵染时间是影响转化效率的重要因素之一。对不同植物的外植体而言，菌液浓度也有一定差异。对于农杆菌敏感的植物，因其易产生过敏反应而导致外植体切口处褐化，因此宜采用较低的OD值和较短的浸泡时间。如果外植体在菌液中浸泡时间太长，常因农杆菌毒害缺氧而软腐，同时外植体在培养过程中也容易产生农杆菌污染；而若浸泡时间太短则因尚未接种到伤口面，不能转化。关于侵染时间，不同的学者采用不同的侵染时间，从30 s到 30 min都有，这可能是因为品种间存在差异。张秀海（2000）采用 30 min的侵染，而张建民（1999）将子叶与农杆菌侵染时间仅为30 s，程英豪（1997）等采用 3 min的侵染，叶志彪（1994）等采用5 min。（4）预培养：关于外植体在转化前是否进行预培养，预培养的效果如何，许多研究结果不同。是否需要预培养、预培养多长时间，要根据不同植物、不同外植体而确定。曾有人研究报道番茄的叶片转化需2 d预培养（王关林等，2002）。张赛群（1999）实验发现，同一品种的番茄经过预培养后的转化再生频率比未经过预培养的高，实验所用品种A21的子叶外植体经预培养进行转化的平均再生频率为5.70%，但是未经预培养的子叶再生频率仅为4.80%。（5）筛选剂：目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂的抗性。筛选标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们通常可以使转基因细胞产生对某种筛选剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种筛选剂的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此筛选剂的敏感性，不能生长、发育和分化。因此，对转化体的筛选要选择适宜的筛选剂浓度，而这一浓度要通过测定受体材料的基础抗性来确定。筛选剂浓度必须适宜，才能有效筛选出抗性芽。筛选剂浓度太高，会导致转化的外植体死亡，抗性芽不能诱导；浓度过低，抗性芽中转基因芽的比例偏低。（6）转化体的筛选和鉴定：对于一个成熟的转基因系统，外源基因导入与否要有确凿的证据，其中包括：①严格的对照；②转化当代（R0）需有目的基因控制的表型性状，如抗生素抗性、抗除草剂等；③应有转化当代（R0）目的基因整合和表达的分子生物学证据（如PCR、Southern blotting、Northern blotting和Western blotting）。

本文主要通过实验分析菌液侵染时间、预培养、共培养、筛选压等因素对农杆菌介导的番茄遗传转化的影响，建立理想的番茄遗传转化体系。

1 材料

1.1 菌株、植物材料

菌株：含表达载体的农杆菌

番茄：栽培番茄品系CGN14382

1.2 培养基

1.2.1 LB（Luria-Bertani）液体培养基

分别称取胰蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10g，溶解于800ml去离子水中，调pH至7.0，加去离子水至总体积1L，分装高压蒸汽灭菌20分钟。

1.2.2 MSBV培养基

Murashige & Skoog Medium Macro Salt Mixture MS                  1.652g

Murashige & Skoog Medium Micro Salt Mixture MS                  1.000g

Gamborg B5 Vitamin Mixture to prepare a 1000×vitamin stock solution   0.112g

加水至1L，pH5.8，固体培养基则加入0.8%琼脂粉。（Duchefa Biochemie）

1.2.3 转基因番茄组织培养培养基

分化培养基：MSBV + ZT 1 mg/l + IAA 0.1 mg/l + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂粉，pH5.8

筛选培养基：MSBV + ZT 1 mg/l + IAA 0.1 mg/l + Carb 500 mg/l + PPT 10 mg/l + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂粉，pH5.8

生根培养基：MSBV + IBA 0.05 mg/l + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂粉，pH5.8

1.3主要仪器和设备

ZHJH－1109B型超净工作台（上海智城分析仪器制造有有限公司）

RXZ智能型人工气候箱（宁波江南仪器厂）

1.4 主要试剂

Zeatin，ZT（Sigma）

Indole-3-acetic acid， IAA（国产）

Glufosinate-ammonium ，PPT（sigma）

羧苄青霉素，Carb（德国）

利福平， Rif（国产）

壮观霉素， Spe（国产）

硫酸链霉素， Str（国产）

乙酰丁香酮，AS（国产）

2 方法

2.1 筛选压的确定

在进行转化试验之前首先进行了番茄下胚轴段对除草剂PPT的敏感性试验，将8 d苗龄的番茄无菌幼苗下胚轴剪切后接种到添加了不同浓度PPT（0 mg/l，2.5 mg/l，5 mg/l，7.5 mg/l，10 mg/l）的分化培养基上进行培养，选择最佳的筛选浓度，每个浓度处理100个下胚轴段，重复3次。

2.2 外植体的预培养

取8 d苗龄的番茄无菌幼苗下胚轴，切成1 cm左右的下胚轴段，均匀放在分化培养基上，恒温25℃，16 h光照（2000 lx）预培养0~4 d。

2.3 农杆菌侵染液的制备

（1）挑取农杆菌单菌落接种于20 ml含有Rif 50 mg/l、Spe 50 mg/l、Str 50 mg/l的LB培养基中，28℃振荡培养过夜。

（2）按1：100的比例转接到不含抗生素的LB培养基中，继续培养至对数期（OD600为0.8~1.0）。

（3）取适量菌液，4℃、6000 rpm离心10 min，收集菌体。

（4）将菌体重悬于MSBV液体培养基中，并将其稀释到OD600为0.01~0.1左右，再加入200 μmol/l的乙酰丁香酮（AS），室温下，静置1~2 h备用。

2.4 侵染

取出经过预培养的下胚轴段，放入制备好的农杆菌菌液中，室温下不断轻轻摇动，使外植体与农杆菌充分接触，5~25 min后取出下胚轴段，放在培养皿里的无菌滤纸上几分钟，吸去外植体表面多余的菌液。

2.5 共培养

用镊子小心夹起无菌滤纸上侵染后的下胚轴段，放回分化培养基上恒温25℃，16 h光照（2000 lx）共培养0~4 d。

2.6 转化体的筛选与抗性植株的再生

（1）将共培养后的下胚轴段放入100 ml有液体培养基（1/2 MSBV + 500 mg/l Carb）的小三角瓶中，冲洗3次，每次20 min，其间不停轻轻摇晃小三角瓶，使下胚轴段外表面的农杆菌杀死。

（2）把下胚轴段转移到铺有灭菌滤纸的培养皿中，吸去下胚轴段表面多余的水分，转入筛选培养基上（恒温25℃，16 h光照，强度为2000 lx）培养，诱导芽的再生。

（3）当不定芽长到1 cm以上时，从基部切下，移入生根培养基中诱导生根。

3 结果

3.1 草胺磷PPT筛选浓度的确定

为确保再生植株为转基因植株，确定未转化番茄外植体对筛选压的耐受力是很有必要的。转化细胞的筛选是获得转基因植株的关键，选择压直接影响对转化子的筛选和转化效率。选择压低时，逃逸多，假转化子增加；选择压高时，真转化子不能承受高选择压而被抑制，转化率降低。本实验所转化的嵌合基因赋予植物细胞对草胺磷PPT有抗性，随着PPT浓度的增加，下胚轴段分化率逐渐下降，当PPT浓度为10mg/l时虽然最初也能分化，但最终萎缩变黄，最后死亡，所以选择10mg/l的PPT作为此番茄品种的筛选压。结果如表1。

表1 筛选压PPT的浓度对下胚轴分化率的影响

注：分化率 = 分化芽的下胚轴段数/总下胚轴段数

3.2 预培养天数对下胚轴段分化率的影响

研究了0~4 d预培养对番茄下胚轴分化率的影响，发现未预培养和预培养后侵染的差别显著。不经预培养，下胚轴直接侵染，伤口褐化严重，外植体产生抗性愈伤的能力很弱，外植体变黑、萎蔫；当预培养时间为2d时，分化率最高（见表2）。但过长时间的预培养，伤口有愈合和封闭的趋势，使侵染能力下降，下胚轴的分化率随之下降。所以选择2d

预培养时间进行遗传转化。结果如表2。

表2 预培养天数对分化率的影响

注：分化率 = 具有分化能力的下胚轴段数/总下胚轴段数

3.3 农杆菌侵染时间对下胚轴段分化率的影响

农杆菌吸附在细胞表面是T-DNA转移及整合的前体，从表3可以看出，5~20 min内，适当延长侵染时间，有利于农杆菌的吸附，分化率随时间的延长而升高。在20~25 min内，随着侵染时间的延长，由于农杆菌的毒害作用使植物材料的坏死，导致分化率下降。实验结果表明，以20 min的侵染时间为最佳，下胚轴的分化率最高，因此，确定以20 min为农杆菌侵染外植体的时间。

表3 不同侵染时间对下胚轴分化产生的影响

注：分化率 = 具有分化能力的下胚轴段数/总下胚轴段数

3.4 共培养时间对转化效率的影响

农杆菌和外植体的共培养在整个转化过程中是非常重要的环节，T-DNA的转移及整合都在共培养时间内完成。共培养时间对转化效率有很大的影响，而且不同的植物最佳共培养时间不同。番茄下胚轴与农杆菌分别共培养1、2、3、4 d后转化效率分别为2、9、4、3%（表4）。转化受体与农杆菌共培养1 d后的转化效率较低，2 d后显著提高，3 d后降低，这可能是继续延长共培养时间的结果，农杆菌生长过度抑制了植物细胞生长，导致外植体受毒害而死亡，使芽的诱导率下降。而且农杆菌生长过度，抗生素难以抑制其生长而最终导致外植体因农杆菌污染而死亡。

表4 共培养时间对芽诱导率的影响

注：转化效率 = 芽分化的下胚轴段数/总下胚轴段数

4 结论

研究了若干因素对农杆菌介导的番茄遗传转化的影响，建立了一个较为理想的番茄遗传转化体系：下胚轴在分化培养基上预培养2 d；侵染时间为20 min；共培养时间为2 d；草胺磷 PPT 对下胚轴的筛选压为10 mg/l；当芽长到1 cm以上时，将抗性芽切下，转入MSBV + 0.05 mg/l IBA的生根培养基中诱导生根。

5 讨论

本实验所用的筛选剂为草胺磷PPT，PPT是一种很强的细胞生长抑制剂，为抑制杀死非转化细胞同时又保证转化细胞能正常生长，必须确定合适的PPT筛选浓度。本实验研究结果表明，番茄对PPT非常敏感，当达10mg/l时，下胚轴已基本黄化并慢慢变黑死亡，因此确定PPT使用浓度为10mg/l。转化体的筛选有两种方法：一是先再生后选择，即先在分化过程中不加选择压，获得了不定芽后再在生根培养基中加选择压。这种方法获得的再生苗较多，但假转化体较多，后期工作量大；再一种方法是先选择后再生，即在不定芽分化一开始就加入选择压，使非转化细胞的生长受到抑制，只有转化的细胞能进行正常生长，这种方法得到的再生苗少，但假转化体也少。本实验采用的是一开始就加选择压的方法效果较好。在番茄的筛选培养过程中，需加入羧苄青霉素来抑制农杆菌的生长，程振东（1992）、Kuvshinov（1996）等研究认为羧苄青霉素促进芽的分化，但抑制根的生长，所以本实验在芽分化的筛选培养基中加入羧苄青霉素，而在生根培养基中不加，效果较好。

参考文献

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