南昌大学第二附属医院 麻醉科 广西南昌 330006
【摘要】目的:深入探究TLR4-MyD88-NF-κB信号通路通过炎症反应参与双歧杆菌改善术后神经认知紊乱。方法:①建立采用剖腹探查术制备大鼠PND模型;②80只大鼠随机分为5组:对照组(Con,n=20只):仅用生理盐水灌胃;双歧杆菌灌胃组(B-MIX,n=20只):仅接受双歧杆菌灌胃治疗;手术加生理盐水组(S-S,n=20只):仅行剖腹探查术;手术加双歧杆菌灌胃组(S-B-MIX,n=20只):在剖腹探查前接受双歧杆菌灌胃治疗;手术加双歧杆菌灌胃加TLR4激动剂组(S-B-MIX-LPS,n=20只):接受双歧杆菌灌胃治疗后,行剖腹探查缝合时腹腔滴入TLR4激动剂牙龈卟啉单胞菌内毒素(LPS-PG)。结果:在Y-maze测试中,观察到B-MIX组大鼠表现出更高的探索行为和记忆能力,与Con组相比,B-MIX组大鼠展现出更高的活动水平和更长的停留时间(P<0.05);Elisa检测结果显示,B-MIX组大鼠尾静脉血中IL-1β、TNF-α和IL-6水平明显降低,而海马区IL-1β、TNF-α和IL-6水平也呈现明显下降的趋势(P<0.05);Western blot结果显示,B-MIX组大鼠海马区TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白的表达水平显著下调,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。结论:双歧杆菌可以通过抑制外周血炎性因子的升高及改善血脑屏障,降低TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的激活,抑制炎性反应从而改善PND。
【关键词】TLR4-MyD88-NF-κB信号通路;炎症反应;双歧杆菌;神经认知紊乱
0 引言
术后神经认知紊乱(PND)是一种常见的并发症,特别是在老年患者中[1]。随着人口老龄化的加剧,PND对患者的生活质量和长期健康产生了严重影响,因此引起了广泛关注。目前,尽管在手术技术和麻醉管理方面取得了进步,但PND的发病机制尚未完全阐明,治疗手段也相对不足。针对PND的治疗和预防,寻找有效的干预手段具有重要意义。近年来,肠道微生物组的研究表明,肠-脑轴可能在神经系统疾病的发生和发展中起着重要作用[2]。双歧杆菌作为一种益生菌,在调节肠道微生态平衡、改善肠道屏障功能、抑制炎症反应等方面显示出潜在的益处[3]。因此,探究双歧杆菌对PND的影响及其可能的作用机制,对于深入理解PND的发病机制、开发新型治疗策略具有重要意义。本研究旨在探究TLR4-MyD88-NF-κB信号通路在双歧杆菌改善PND中的作用机制,为进一步研究PND的发病机制提供新的思路和证据,为PND的治疗和预防提供新的靶点和策略。通过揭示肠道微生物与神经系统之间的相互作用,有望为未来疾病的治疗开辟新的途径,为老年患者提供更好的医疗服务和生活质量。
1 材料与方法
1.1 研究对象
所有雄性Sprague-Dawley老龄大鼠(年龄,20个月;体重,500-650克)均来自南昌大学实验动物中心。所有大鼠均经过了一周的常规驯化期,并在温度和湿度控制的室内(分别为22±1℃和50-60%),以正常的12h光暗周期分组饲养。
1.2 方法
1.2.1模型建立与分组
1.2.1.1 PND造模
①用1.5%异氟醚麻醉小鼠;②半小时后,切口被消毒(注:腹部中线约1cm处的切口是为了穿透腹腔);③观察大鼠的内脏和肌肉组织;④腹膜衬里和皮肤用无菌4-0铬肠线缝合;⑤切口用polysporin(美国辉瑞公司)包扎以防止感染;⑥手术时间为10min,同时采用异氟醚麻醉;⑦对照组未行麻醉或手术。
1.2.1.2 实验分组
将80只大鼠随机分为5组。
①对照组(Con,n=20只):仅用生理盐水灌胃。
②双歧杆菌灌胃组(B-MIX,n=20只):仅接受双歧杆菌灌胃治疗。
③手术加生理盐水组(S-S,n=20只):仅行剖腹探查术。
④手术加双歧杆菌灌胃组(S-B-MIX,n=20只):剖腹探查前接受双歧杆菌灌胃治疗
⑤手术加双歧杆菌灌胃加TLR4激动剂组(S-B-MIX-LPS,n=20只):接受双歧杆菌灌胃治疗后,行剖腹探查缝合时腹腔滴入TLR4激动剂牙龈卟啉单胞菌内毒素(LPS-PG)。
每组取10只大鼠于术后第3、7天进行Y迷宫实验。提取尾静脉血样。用2%戊巴比妥钠(50mg/kg;腹腔注射)麻醉小鼠,然后横断颈髓处死。快速取出海马,对称切成两部分,分别置于-80℃液氮中保存待分析。
1.2.2 Y-maze实验
目的:检测大鼠认知功能
①Y-maze装置由三条等长的黑色臂和一个中间区域组成,每只臂彼此成120°角,臂长、宽、高分别为50cm、10cm、20cm,支架高50cm;②在大鼠被放进去后,使用智能软件(smart
,PanlabHarwardInstrument,BioscienceCompany,Holliston,MA,USA)收集图像和分析数据;③Y-maze需持续2d;④第一天是自主神经交替实验;⑤每只大鼠置于起始臂的同一臂上,持续8min,检测自主交替率;⑥每次实验结束后,将大鼠放回笼中,在下一次实验前,用75%的酒精消除Y-maze臂部的异味。交替率%=交替次数/(总次数-2)%;⑦第二天是一个4h间隔的新奇探索实验;⑧随机地关闭Y-maze装置的一只手臂,让大鼠在其余两只手臂自由探索10min;⑨4h后打开挡板;⑩每只大鼠自由探索5min;⑪需记录进入每只手臂的次数和时间;⑫每次实验结束后,将大鼠放回笼中;⑬在下一次实验前用75%的酒精消除Y-maze臂部的异味。
1.2.3 Elisa法
目的:检测大鼠尾静脉血及海马炎症反应(IL-1β、TNF-α和IL-6)
(1)尾静脉血:①在4℃离心1000r/min,10min;②取上清液;③按ELISA试剂盒指示检测表达水平。
(2)海马:①将两份中的一份海马体称重;②加入含有少量预冷酸化正丁醇的玻璃均质器中;③研磨成均质液体;④4℃,3000r/min离心15min;⑤取上清液;⑥按ELISA试剂盒检测表达水平。
1.2.4 Western blot法
目的:检测大鼠海马TLR4、MyD88和NF-κB的表达
①将两部分的另一份海马研磨成均匀的液体;②加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂;③4℃和12000r/min离心10min;④取出上清液;⑤用BCA法测定蛋白浓度;⑥取蛋白样品;⑦进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,低温下(使用前将PVDF膜浸入无水甲醇中5min),5%脱脂乳,在37℃下,密封1h;⑧将目标蛋白电湿转移至PVDF膜上,稀释后的蛋白单克隆抗体分别加入,4℃孵育过夜;⑨经3次PBST清洗后,用辣根过氧化物酶标记的兔II抗体(1:5000)在室温下孵育2小时;⑩经3次PBST清洗后,加入ECL作为化学发光底物1分钟;⑪用ImageQuant LAS 4010扫描分析蛋白条带。
1.2.5 统计学方法
使用GraphPad Prism 5.0进行统计分析。数据均采用均数±标准差()表示,多组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析,t检验分析两组间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Y-maze测试认知行为学结果
在Y-maze测试中,观察到B-MIX组大鼠表现出更高的探索行为和记忆能力,与Con组相比,B-MIX组大鼠展现出了更高的活动水平和更长的停留时间,P<0.05,这表明双歧杆菌对改善术后神经认知紊乱具有显著的认知行为学效应。
表1 Y-maze测试认知行为学结果
分组 | 固定时间 (s) | 有效进入率 (%) | 张开双臂的时间 (s) |
Con(n=20只) | 50.01±1.33 | 34.78 | 50.66±1.63 |
B-MIX(n=20只) | 52.09±1.35 | 31.18 | 48.97±1.35 |
S-S(n=20只) | 146.69±1.93 | 76.07 | 13.02±1.26 |
S-B-MIX(n=20只) | 60.27±1.03 | 58.84 | 12.54±1.32 |
S-B-MIX-LPS(n=20只) | 65.31±1.83 | 56.83 | 12.38±1.02 |
t | 10.686 | 11.698 | 9.626 |
P | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
2.2 Elisa法检测尾静脉血和海马IL-1β、TNF-α和IL-6结果
Elisa检测结果显示,B-MIX组大鼠尾静脉血中IL-1β、TNF-α和IL-6水平明显降低,而海马区IL-1β、TNF-α和IL-6水平也呈现明显下降的趋势,与对照组相比差异显著,P<0.05,说明双歧杆菌治疗能够有效抑制炎症因子的释放。
表2 尾静脉血和海马IL-1β、TNF-α和IL-6结果
分组 | IL-1β (ng/ml) | TNF-α (pg/ml) | IL-6 (pg/ml) | |||
尾静脉血 | 海马 | 尾静脉血 | 海马 | 尾静脉血 | 海马 | |
Con (n=20只) | 495.48±51.15 | 9.08±1.32 | 325.52±113.6 | 6.31±0.21 | 495.15±19.03 | 6.53±1.19 |
B-MIX (n=20只) | 476.03±50.14 | 8.71±1.01 | 315.1±109.94 | 5.62±0.23 | 465.93±10.59 | 5.02±1.49 |
S-S (n=20只) | 3966.65±109.23 | 21.63±1.78 | 4166.8±191.98 | 45.53±3.63 | 4065.2±11.21 | 41.54±0.35 |
S-B-MIX (n=20只) | 2966.01±115.27 | 16.45±1.33 | 3865.49±117.98 | 35.61±3.77 | 2966.42±15.32 | 32.09±1.53 |
S-B-MIX-LPS (n=20只) | 3016.05±99.42 | 15.59±1.91 | 3955.27±125.38 | 37.93±4.82 | 3064.84±10.59 | 34.26±1.77 |
t | 11.723 | 9.177 | 10.126 | 8.622 | 9.841 | 10.572 |
P | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
2.3 Western blot法检测PND大鼠海马区TLR4、MyD88及NF-κBp65蛋白的表达水平结果
Western blot结果显示,B-MIX组大鼠海马区TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白的表达水平显著下调,与对照组相比具有统计学意义,P<0.05,见图。
表3 PND大鼠海马区TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白的表达水平结果
分组 | TLR4 | MyD88 | NF-κB p65 |
Con(n=20只) | 0.18±0.04 | 0.28±0.19 | 0.25±0.29 |
B-MIX(n=20只) | 0.16±0.06 | 0.26±0.04 | 0.23±0.27 |
S-S(n=20只) | 0.35±0.49 | 0.72±0.63 | 0.72±0.74 |
S-B-MIX(n=20只) | 0.21±0.55 | 0.46±0.65 | 0.35±0.18 |
S-B-MIX-LPS(n=20只) | 0.24±0.42 | 0.51±0.58 | 0.42±0.34 |
t | 10.659 | 20.568 | 18.688 |
P | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
3 讨论
基于本文研究内容和拟解决的关键问题,得出以下结论:首先,在术后神经认知紊乱的研究中,观察到大鼠认知功能受到影响,同时伴随着炎性反应的增加。这表明术后神经认知紊乱与炎性反应密切相关,可能由于术后炎性反应导致神经元功能异常而引起认知功能下降。其次,通过双歧杆菌治疗大鼠术后神经认知功能的实验观察到,双歧杆菌能够显著改善大鼠的认知功能,并且能够减轻外周和海马内的炎性反应。这表明双歧杆菌可能通过调节炎性反应来改善术后神经认知紊乱。进一步的实验发现,TLR4-MyD88-NF-κB信号通路在术后神经认知紊乱中发挥了重要作用。该信号通路的活化与PND的发生密切相关[4]。双歧杆菌治疗能够降低TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的激活水平,从而减轻炎性反应,改善PND的症状。最后,综合分析双歧杆菌治疗术后神经认知紊乱的机制,发现其可能通过抑制外周血炎性因子的升高,改善血脑屏障功能,降低TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的活化水平,从而抑制炎性反应,进而改善PND的发生和发展[5]。综上所述,本研究证实了双歧杆菌能够改善术后神经认知紊乱的认知功能,并揭示了其可能的作用机制,为进一步研究和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
参考文献:
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[2]林朋朝,周晓彬,高伟静,等.盘龙七片调控Toll样受体4-骨髓样分化因子88-核因子-κB通路保护佐剂性关节炎大鼠滑膜组织[J].安徽医药,2021,25(9):1713-1717,后插1.
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江西省教育厅科学技术研究项目项目名称:TLR4-MyD88-NF-κB信号通路通过炎症反应参
与双歧杆菌改善术后神经认知紊乱的研究
课题编号:200249