两种同时检测速溶咖啡粉中赭曲霉毒素A方法

两种同时检测速溶咖啡粉中赭曲霉毒素A方法

王佳佳

天津市乳品食品监测中心有限公司   天津市  邮编300381

目的：对比两种同时检测速溶咖啡粉中赭曲霉毒素A（OTA）的方法。方法：考察不同淋洗液、洗脱液以及提取液，结合免疫亲和柱净化效果，对比高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）与液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）测定OTA的检出限、定量限、准确度以及精密度，评价方法的适用性。结果：在优化前处理条件后OTA的线性范围为0.50～100ng/mL，HPLC-FLD测定相关系数为0.9999，检出限为1.0μg/kg，定量限为2.0μg/kg，方法的回收率为81.0%～95.2%（RSD 0.66%～3.77%）；LC-MS/MS测定相关系数为0.9998，检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg，方法的回收率为82.6%～98.3%（RSD 0.89%～3.82%）。结论：本方法前处理操作简便、准确度高、灵敏度好，HPLC-FLD与LC-MS/MS均适用于速溶咖啡粉基质中OTA检测要求。

关键词：赭曲霉毒素A；速溶咖啡粉；免疫亲和柱

据《2023中国城市咖啡发展报告》统计，过去三年中国线上速溶及即饮咖啡销售规模持续增长，其中速溶咖啡规模占比最高。根据美团数据测算，2022年中国咖啡产业规模2007亿元，预计2025年中国咖啡产业规模将达到3693亿元，呈现飞速增长。而研究[1]表明，咖啡及其产品在采收、加工、贮藏过程中易受到霉菌的侵染，产生各种真菌毒素。Bessaire等[2]采集多个国家咖啡样本，多数样本中含有多种霉菌毒素，其中赭曲霉毒素A（OhratoxinA，OTA）毒性最大以及含量最高，它是一种已知的肾脏致癌物质，对人类健康构成严重风险。Benites等[3]曾采用HPLC-FD法检测葡萄牙市售烘焙咖啡中OTA的污染水平，其中烘焙咖啡OTA污染的平均值为1.84 mg/kg，最高含量可达10.31mg/kg。

结合中国咖啡中OTA污染及产品消费量情况，GB 2761-2017新增了咖啡中OTA限量，咖啡豆和咖啡粉中OTA限量标准为5.0μg/kg，速溶咖啡中OTA限量标准为10.0μg/kg。现有GB 5009.96-2016第二法离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法中咖啡基质的检出限和定量限分别为1.0μg/kg和3.3μg/kg；第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法中生咖啡以及熟咖啡基质的检出限和定量限为0.5μg/kg和1.5μg/kg。

目前针对OTA的检测方法已比较成熟[4-6]。鉴于此，本研究基于速溶咖啡粉基质效应，通过样品前处理条件的改善，利用针对目标毒素的高特异性单克隆抗体凝胶悬浊液特点的OTA免疫亲和柱，建立同时用LC-MS/MS与HPLC-FLD检测速溶咖啡粉样品中的OTA，净化效果好、方法准确、回收率高、精密度好的检测方法，为实际检测提供方法参考。

1实验仪器与试剂

液相色谱-串联质谱岛津LC30A-8050（LC-MS/MS），高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD），涡旋混合器XH-C，GT10-1型高速台式离心机，固相萃取仪装置，OTA免疫亲和柱品牌来源德国拜发、迪马、艾杰尔。OTA标准品来自阿尔塔有限公司；于市场购买的雀巢速溶咖啡粉；乙腈、甲醇、甲酸，为色谱纯；氯化钠、碳酸氢钠、冰乙酸，为分析纯；试验用水均为超纯水。

2实验方法

2.1标准储备液和工作液的配制

赭曲霉毒素A标准中间液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准溶液，用乙腈配成1.00μg/mL的标准中间液，于-20℃避光保存。

赭曲霉毒素A标准工作液系列：根据使用需要移取一定量的赭曲霉毒素A标准中间液，用50%甲醇水稀释，分别配成相当于0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液。现用现配。

2.2实验步骤前处理优化

(1)实验优化因素的选择：变量A.淋洗液（1-PBS溶液、2-水）；变量B.洗脱液（1-甲醇，2-甲醇：冰乙酸（49+1）、3-乙腈：甲酸（49+1））；变量C.免疫亲和柱品牌（1-艾杰尔、2-迪马、3-德国拜发）；变量D.提取液（1-80%甲醇水溶液、2-1g氯化钠+80%甲醇水溶液、3-含1%碳酸氢钠的60%乙腈水溶液、4-含3%碳酸氢钠的50%甲醇水溶液），得到的结果进行比较，从而优化前处理条件。

(2)实验步骤：提取：称取混匀试样5g于50 mL具塞聚丙烯离心管中，加入提取液D20mL，涡旋30 s，超声30 min，8000 r/min离心5 min，移取上清液4mL于另一离心管中，加30mL淋洗液A，稀释混匀，全部通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱C（注意柱容量），控制速度1滴/1秒，过完后，用10mL淋洗液A洗柱，10mL超纯水洗柱，抽干小柱，用2mL洗脱液B，过0.22 μm滤膜，供LC-MS/MS测定，若供HPLC-FLD测定，需用水进行稀释1倍上机。

2.3 LC-MS/MS与HPLC-FLD仪器条件

（1）LC-MS/MS液相条件

液相色谱柱：Water HSS T3，1.8 μm，2.1*50 mm；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0-1.3min，35%B~95%B，1.3-1.8min，95%B，1.8-3.0min，95%~35%B，3.0-6.0min，35%B，流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL，柱温为40℃。

（2）LC-MS/MS质谱条件

电喷雾电离源（ESI），负离子扫描；雾化气及流量：氮气，3.0 L/min；干燥气及流量：氮气，10.0 L/min；加热气及流量：空气，10.0 L/min；碰撞气及压力：氩气，270 K Pa；接口温度：300℃；脱溶剂管温度：250℃；加热块温度：400℃。使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件及检测离子对（M/Z）参见表1。

表1  药物的MRM参数表

*表示定量离子对

（3）HPLC-FLD色谱条件

色谱柱：DiKMA Spursil C18，5μm，4.6*250 mm；流动相:2%冰乙酸溶液：乙腈=52%：48%，流速：0.8mL/min；进样量：50 μL，柱温：40℃，检测波长：激发波长333nm，发射波长460nm。

3分析和结果

3.1提取方法的优化

3.1.1 洗脱液以及淋洗液的确定

首先采用免疫亲和柱柱效的方法，确定洗脱液以及淋洗液，柱效的方式避免了前处理对赭曲霉毒素A回收率的损失。取适量的标准溶液分别采用不同的淋洗液进行稀释为浓度5ng/mLOTA标准溶液，取10mL上柱，按照上述中实验步骤进行，最终采用不同的洗脱液，分别用HPLC-FLD以及LC-MS/MS上机。因此，以淋洗液（变量A）、洗脱液（变量B）和免疫亲和柱不同品牌（变量C），分别进HPLC-FLD以及LC-MS/MS为考察因素，得到18组正交试验的柱效结果平均回收率数据，见表2。如表2所示，对于不同品牌的免疫亲和柱（变量C），其淋洗液（变量A）和定容液（变量B）的柱效平均回收率结果表明，相对选择淋洗液A2（水）与洗脱液B3（乙腈：甲酸（49+1）），都可以满足柱效回收率≥80%的要求。

表2  三因素柱效试验的处理和实验结果表

3.1.2提取液的优化

其次采用基质空白以及基质加标的方式，确定提取液。试验现象说明：进行雀巢咖啡速溶粉加上提取液未上柱实验步骤时，发现变量D4稀释后溶液出现浑浊状态，不利上柱，舍弃。变量D3稀释后溶液有絮状物产生，通过离心冷冻等手段均无效果，但可上柱，出现过柱速度慢的状态。变量D1与变量D2，过柱速度可控。因此，以提取液（变量D1~D3）和免疫亲和柱不同品牌（变量C），分别进HPLC-FLD以及LC-MS/MS为考察因素，得到9组正交试验的加标回收率结果数据，见表3。如表3所示，可根据不同免疫亲和柱品牌（变量C），不同的仪器检测，选择适合的提取液，相对选择提取液D2（1g氯化钠+80%甲醇水溶液20mL），都可以满足基质加标回收率的要求。

表3  加标试验的处理和实验结果表

3.2线性关系、检出限与定量限

结果表明，目标化合物在0.50～100 ng/mL的范围内线性关系良好，在HPLC-FLD的标准曲线的线性方程：f(x)=2733.69*x-243.098（相关系数为0.9999），在LC-MS/MS的标准曲线的线性方程：f(x)=34536.1*x+1404.41（相关系数为0.9998），都具有良好的线性关系。使用HPLC-FLD，OTA的检出限为1.0μg/kg，定量限为2.0μg/kg；使用LC-MS/MS，OTA的检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg。两种方法均适合速溶咖啡粉中OTA的检测。本方法的检出限与定量限比已知方法略低，这可能是通过改进提取液等的方式，能够去除速溶咖啡粉中的杂质，保留定量物质。

3.3准确度和精密度

向空白速溶咖啡粉中进行加标回收（谱图见1-6），OTA添加水平浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL，分别计算其加标回收率。使用HPLC-FLD，OTA在2.0μg/kg~20μg/kg添加浓度水平上的回收率为81.0%～95.2%（RSD 0.66%～3.77%），使用LC-MS/MS，OTA在1.0μg/kg~10μg/kg添加浓度水平上的回收率为82.6%～98.3%（RSD 0.89%～3.82%），回收率均在80%以上且RSD均小于5.3%，证明该方法对OTA准确度以及精密度良好，均可以满足分析要求。

4结论

本研究对比两种同时通过优化前处理步骤检测速溶咖啡粉中OTA的方法，结果表明不仅在优化方法GB5009.96-2016（第三法），还可以在第一法适用类别中增加速溶咖啡粉以及第二法中增加免疫亲和层析柱净化提供检测依据，且前处理操作简便、回收率高、灵敏度以及重现性较好，同时对选择不同价格品牌的免疫亲和柱，各检测机构根据自身需要可降低实验耗材成本。HPLC-FLD与LC-MS/MS均适用于速溶咖啡粉基质中OTA检测要求。

参考文献

[1]VIEGAS C，PACIFICOC，FARIA T, et al. Fungal contamination in green coffee beans samples: A public health concern[J]. Journal of  Toxicology and Environmental Health, 2017, 80: 719-728.

[2]BESSAIRE T, PERRIN I,TARRES A, et al. Mycotoxins in green coffee: Occurrence and risk assessment[J]. Food Control, 2019,96:59-67

[3]Benites AJ, Fernandes M, Boleto AR, et al. Occurrence of ochratoxin A in roasted coffee samples commercialized in Portugal [J]. Food Control,2017, (73B): 1223-1228.

[4] 翟若涵，蔡瑞，高振鹏，等.食品中赭曲霉毒素A检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2020，11（12）：3937-3944

[5] 徐志，刘春华，李春丽，等.咖啡中赭曲霉毒素A研究进展[J].安徽农业科学，2011,39（8）:4760-4761

[6] 徐梦文，王荣荣，王爱灵，等.食品中黄曲霉毒素B1与赭曲霉毒素A检测方法的研究进展[J].中国食品工业，2023,10:81-84